隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，已解決了不可培養(yǎng)微生物研究的難題，使得腸道微生物的研究進入一個新的階段，NGS高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究者可以基于16S rDNA/18S rDNA基因，利用二代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq），獲得龐大的數(shù)據(jù)信息，通過生物信息學(xué)手段，來分析腸道微生物的多樣性，通過統(tǒng)計分析，對大量數(shù)據(jù)進行PCA和PCoA分析，得出發(fā)病前后樣本間腸道微生物主要組成成分是否存在差異；并進一步通過RDA分析，找到與環(huán)境因子（疾病等）相關(guān)的微生物群落組成，從而達到預(yù)防疾病的發(fā)生的目的。
研究案例：
1、結(jié)直腸癌與腸道微生物
Tingting Wang等采用454測序技術(shù)研究結(jié)直腸癌（CRC）患者與正常人群腸道微生物的菌落組成差異。并結(jié)合real-time PCR對相關(guān)基因進行分析，最終確定丁酸鹽產(chǎn)生菌的減少和一些致病微生物的增加使得CRC患者腸道微生物菌落的失衡。
研究對象： CRC患者46人，健康人群56人
研究區(qū)域：V3區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）PCA主成分分析（圖a）和PCoA主坐標(biāo)分析（圖b）顯示CRC患者與正常人腸道微生物存在差異。藍色圓圈代表正常人，紅色圓圈代表CRC患者
（2）對CRC患者與正常人樣本在98%相似水平上OTU的相對豐度進行RDA分析，找到健康人群與CRC疾病患者相關(guān)的微生物類群，進行分析與CRC疾病相關(guān)的主要微生物類群。有48個OTU可以作一個關(guān)鍵變量與CRC患者和正常人腸道微生物結(jié)構(gòu)差異存在顯著相關(guān)性。
（3）Heatmap分析：48個OTU的相對豐度作為健康人和CRC患者腸道微生物差異的主要變量，他們在樣本中的分布情況見下圖。圖左側(cè)黑色OTU代表在正常人中相對豐富，紅色OTU代表在CRC患者中相對豐富，每個樣本的顏色強度代表在所有樣本中的相對比率。
2、二型糖尿病與腸道微生物
Larsen等研究二型糖尿病患者腸道微生物與非糖尿病人群的差異，采用454測序技術(shù)結(jié)合qPCR技術(shù)對36個樣本腸道微生物進行分析，結(jié)果表明二型糖尿病患者厚壁菌門和唆菌綱微生物比例較對照組顯著降低，但是變形菌綱微生物豐富。Bacteroidetes與Firmicutes的比例、Bacteroides-Prevotella group 與 C. coccoides-E. rectale group的比例與血糖濃度呈正相關(guān)，而與BMI（體重系數(shù)）無關(guān)。變形菌綱微生物同樣與血糖濃度呈正相關(guān)。
研究對象： 二型糖尿病患者18人，正常人18人
研究區(qū)域：V4-V6區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）Rarefaction Curve：確定取樣深度是否合理。
(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者與正常人腸道微生物在門與綱水平的差異。
3 飲食與腸道微生物
為了研究飲食對腸道微生物群落多樣性的影響，F(xiàn)ilippo CD等人比較了15個健康歐洲孩子（EU）及14個健康非洲農(nóng)村孩子（BF）腸道微生物群落的組成。EU的飲食具有典型的西方特色，而BF的食物則能代表傳統(tǒng)的非洲鄉(xiāng)下的飲食構(gòu)成。研究人員通過PCR擴增29個糞便樣品進行高通量測序。RDP數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示94.2%的reads屬于放線菌門（Actinobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes），壁厚菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria），然而它們在EU和BF中的比例具有顯著差異。BF腸道中擬桿菌占大部分，而壁厚菌所占比例較低。有趣的是，含有大量纖維素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例較高。
研究區(qū)域：V5-V6區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
EU（健康歐洲孩子）和BF（健康非洲農(nóng)村孩子）樣本中微生物分布統(tǒng)計
A：BF樣本中主要微生物的分布統(tǒng)計；B：EU樣本中主要微生物的分布統(tǒng)計；
C：全部樣本相似性分析；D：各樣本中主要微生物相對豐度統(tǒng)計；
E：各樣本中革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的相對豐度統(tǒng)計
4 肥胖與腸道微生物
Turnbaugh PJ等人對胖瘦不同的同卵雙胞胎（31對）、異卵雙胞胎（23對）及其母親（46個）共154個個體的腸道微生物進行了研究。結(jié)果表明肥胖與腸道門級微生物的變化相關(guān)，胖人與瘦人相比，微生物多樣性明顯降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）所占比例較低而放線菌門（Actinobacteria）所占比例較高。
A core gut microbiome in obese and lean twins. 2009. Nature.
研究區(qū)域：V2和V6區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）A：不同胖瘦程度個體中主要門級別微生物分布及樣本之間相似性水平分析；
B：第一主成分與主要擬桿菌門（Bacteroidetes）的相關(guān)性分析；
C：雙胞胎之間，雙胞胎與母親，不相關(guān)個體之間微生物功能相似性分析。
（2）根據(jù)隨機序列取樣與物種多樣性分析圖顯示：肥胖人較瘦人體內(nèi)微生物多樣性顯著降低。
5 不同個體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)
人體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在嬰幼兒、成年人和老年人這三類人群中具有顯著的差異，這表明隨著年齡的增長，腸道菌群也歷經(jīng)了巨大的變化。Claesson MJ等人收集了161位65歲以上老人及9位成年人腸道菌群的樣品，進行焦磷酸測序。研究發(fā)現(xiàn)68%的個體腸道中最優(yōu)勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes），平均比例約為57%，壁厚菌門（Firmicutes）所占比例約為40%。但是和一些疾病或健康相關(guān)的菌群在不同個體中所占比例差別極大，包括變形桿菌門（Proteobacteria）,放線菌門（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物組與年青人也有鮮明差異，前者擬桿菌屬所占比例更大，梭菌屬在兩者之間具有不同的豐度模式。分析26組time-0和time-3 month糞便樣品，發(fā)現(xiàn)85%的個體在這兩個時間的微生物組成極其相近，這表明老年人的腸道菌群呈現(xiàn)出時間穩(wěn)定性。
研究區(qū)域：V4區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
A：本研究老年人與青年人糞便中核心微生物在門、屬、梭菌屬的豐度統(tǒng)計（與以往研究者研究成果）；
B：本研究老年人糞便中unique微生物與5個數(shù)據(jù)庫青年個體中unique微生物在門、屬、梭菌屬的豐度統(tǒng)計；
C：本研究中老年人、青年人unique微生物在門、屬、梭菌屬的豐度統(tǒng)計。
基于16S rDNA/18S rDNA基因，優(yōu)化實驗方法，增加對痕量微生物的研究，利用二代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq）來分析口腔微生物的多樣性，得到對微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、種系關(guān)系精確的解析，增加人們對口腔健康與疾病相關(guān)微生物的認識。
研究案例：
1 口腔不同部位的微生物組
Zaura等基于對3個健康個體口腔牙面、頰、硬腭、舌、唾液5個部位的微生物組進行了測序分析，發(fā)現(xiàn)牙齒鄰面微生物多樣性最高，頰部微生物多樣性最低，PCA可以區(qū)分牙表面和軟組織表面的微生物群落。3個個體的微生物組構(gòu)成有較大的重疊，1660個序列（占66%測序內(nèi)容）在3個個體間共同存在。
Defining the healthy “core microbiome” of oral microbial communities.2009.BMC Microbiology.
研究區(qū)域：16S rDNA V5-V6區(qū)域
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)論：
（1）Veen圖說明3個個體口腔不同部位微生物在不同聚類程度下的重疊情況，研究表明，在不同聚類程度下，3個個體的微生物組構(gòu)成有較大的重疊。
（2）左圖為3個個體口腔公有微生物的相對豐度，不同顏色代表不同個體；右圖為在門的分類水平上，每個個體口腔不同位點微生物的相對分布情況。
（3）PCA分析口腔不同部位微生物的差異情況，如圖可見，PCA可以區(qū)分牙表面和軟組織表面的微生物群落。
2口腔真菌微生物研究
Ghannoum等應(yīng)用ITS引物首次鑒定了人類口腔的基本真菌組。健康人的口腔中共檢測出74種已培養(yǎng)的真菌屬和11種尚未培養(yǎng)的真菌屬。假絲酵母菌檢出率最高，接下來依次是枝孢菌、酵母菌、短梗霉、黃曲霉、鐮孢菌、隱球菌屬，其中4種是已知的人體致病菌。
研究區(qū)域：ITS1
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果
（1）樣本中各物種相對豐度統(tǒng)計圖
（2）PCoA分析不同樣本之前物種的相似情況。
3齲病與口腔微生物研究
Belda-Ferre等測序了2個無齲個體、2個輕度齲個體、2個重度齲個體的齦上菌斑，發(fā)現(xiàn)齲病的優(yōu)勢菌并不是變異鏈球菌，而是由數(shù)十個菌種構(gòu)成的復(fù)雜群落。致齲微生物組和正常微生物組在群落結(jié)構(gòu)和基因功能上有顯著的鑒別特征，可以作為齲病防治的生物標(biāo)記；未患齲個體的微生物組是齲病防治的基因資源庫，從中可以尋找有效的抗菌肽和益生菌作為新型的抗齲藥物。
The oral metagenome in health and disease. 2012. The ISME Journal.
研究區(qū)域：宏基因組
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）左圖的Heatmap顯示口腔中細菌相對豐度及多樣性；右圖基于COG功能分類系統(tǒng)，每個分類組對編碼潛在生態(tài)系統(tǒng)的相對貢獻。
（2）口腔和成人腸道樣本中微生物宏基因組的功能模式圖。分類是基于MG-RAST的子系統(tǒng)第二個級別。
4牙周病與口腔微生物
人類口腔中存在大量的微生物，構(gòu)成一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)?？谇粌?nèi)病原菌的擴散會引起牙周病，炎癥性疾病也是引起心血管疾病的一個危險因素。Liu等人對牙周炎患者和健康人的齦下斑樣本的16S rDNA及全基因組進行Roche 454 GS FLX二代測序分析，發(fā)現(xiàn)存在一種未培養(yǎng)的TM7物種，牙周炎患者的口腔微生物群落結(jié)構(gòu)與健康人存在差異，說明在疾病狀態(tài)下，口腔微生物的結(jié)構(gòu)分布會有一定程度的改變。
Deep Sequencing of the Oral Microbiome Reveals Signatures of Periodontal Disease. 2012. PLoS One.
研究區(qū)域：V1-V2區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1） 通過Heatmap分析Genus水平不同樣本中各物種的相對豐度。
（2）示意圖展示由于生活方式改變，導(dǎo)致牙齒和牙齦組織周圍相關(guān)微生物發(fā)生改變，從而使健康的牙齒向牙周炎惡化。
（3）Actinomyces naeslundiiMG1的參考基因組和樣本H1、H2的對比分析。
5口腔癌與口腔微生物
Pushalkar等研究了3個口腔扁平細胞癌患者的唾液微生物組，共發(fā)現(xiàn)8個門的微生物，主要由厚壁菌門和擬桿菌門微生物組成。微生物多樣性極為豐富，包括860個（33%）已知菌種，其中非培養(yǎng)或未歸類的菌種占67%，還有15個獨特種系型在各患者唾液內(nèi)都存在，這說明口腔癌的發(fā)生伴隨有口腔微生物組的結(jié)構(gòu)改變，口腔微生物組有可能用于口腔癌的早期診斷。
Microbial diversity in saliva of oral squamous cell carcinoma. 2010. FEMS.
研究區(qū)域：V4-V5區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
通過VENN圖分析不同樣本中物種（common/unique）的重復(fù)情況：a是口腔癌患者之間；b是對照組之間；c是患者與對照之間。
基于16S rDNA/18S rDNA基因，優(yōu)化實驗方法，增加對痕量微生物的研究，利用二代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq）來分析鼻咽處微生物的多樣性，全面認識人體鼻咽部位微生物的多樣性及不同人群之間的差異性。
研究案例：
小孩子容易得呼吸性感染，且鼻咽部感染主要發(fā)生在秋天和冬天，因此Bogaert等對96個健康的小孩子的鼻咽部微生物進行分析，并比較秋天冬天與春天鼻咽部微生物群落的差異。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽部共包括13個門，約250個種。其中5個主要門為Proteobacteria (64%)，F(xiàn)irmicutes (21%)，Bacteroidetes (11%)，Actinobacteria (3%) and Fusobacteria (1.4%) ，個體間微生物組成差異很大。不同季節(jié)鼻咽部微生物差異顯著不同，這些差異與抗生素的使用和病毒協(xié)同感染是沒有關(guān)系的。
研究區(qū)域：V5-V6區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
50個來自秋冬季的鼻咽部微生物樣本和46個來自春季的鼻咽部微生物樣本的微生物組成模式圖。
早期的皮膚微生物研究主要采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，來識別和描述微生物群落的組成和多樣性。傳統(tǒng)方法的偏向性和局限性，使研究者難以正確全面闡明皮膚微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性特點。高通量測序從根本上改變了人們對微生物群落的認識，從系統(tǒng)的角度去分析和認識皮膚微生物的群落及其功能，而不只是關(guān)注傳統(tǒng)的所謂病原微生物與疾病的關(guān)系。
基于16S rDNA/18S rDNA/ITS基因，優(yōu)化實驗方法，增加對痕量微生物的研究，利用二代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq）來分析皮膚微生物的多樣性，為進一步理解皮膚的健康、疾病和感染等，全面了解皮膚微生物群落的結(jié)構(gòu)特點及其與皮膚組織和環(huán)境的相互關(guān)系。
研究案例：
1 Capone等對新出生嬰兒的皮膚微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)出生后幾天的嬰兒皮膚表面微生物發(fā)生顯著的功能改變。皮膚微生物群落的形成主要在出生后一年內(nèi)，其微生物的多樣性會隨著年齡而增加。新生嬰兒皮膚主要是Staphylococci，它的顯著降低會使得微生物群落均勻性增加。與成年人相同的是嬰兒皮膚微生物群落也是出現(xiàn)在特定的部位，與之有差異的是嬰兒Firmicutes占主導(dǎo)位置。皮膚表面微生物對于建立皮膚穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)炎癥性反應(yīng)有重要作用，所以早期皮膚微生物的定殖對于皮膚免疫功能的發(fā)展至關(guān)重要。
Diversity of the human skin microbiome early in life. 2011. J Invest Dermatol.
研究區(qū)域：V4-V5區(qū)域
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）在Genus水平，根據(jù)最主要的17個物種，對不同位點（胳膊、前額、臀部）皮膚微生物進行菌類分析。
（2）對不同的年齡，身體各部位的所部微生物在Genus水平進行統(tǒng)計分析。
（3）RDA分析最重要的10個Genus的微生物與不同年齡樣本之間的關(guān)系。
2 Blaser等對美國本土居民和委內(nèi)瑞拉一村莊里的印第安人的112個皮膚樣本微生物進行分析，發(fā)現(xiàn)包含20個門，主要為Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria 3種，但是研究發(fā)現(xiàn)印第安人與美國本土居民皮膚微生物在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在差異，這種差異可能是由于地域不同導(dǎo)致環(huán)境氣候不同、人們的生活模式不同、種族的差異，導(dǎo)致皮膚表面微生物群落的差異。
研究區(qū)域：V2區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
采用PCoA分析不同區(qū)域人群皮膚樣本與最顯著的10個OUT之間的關(guān)系。
其中：紅色、藍色、綠色、橙色代表四個不同區(qū)域的人群樣本，灰色代表豐度最高的前10個OUT，灰色圓圈的大小代表OUT的數(shù)目。
