微基生物 您自己的微生態(tài)研究團隊|專注微生態(tài)研究與應(yīng)用
在人體腸道中生活著數(shù)以萬億的共生菌群，它們的種類繁多，可達上千種，數(shù)量也很驚人，是人體細胞總量的10倍以上，迄今為止，仍有80%以上的微生物不為人知。這些腸道微生物和人體存在著互利共生的關(guān)系，對于維持人類的健康發(fā)揮著重要的作用。當腸道內(nèi)平衡因某些因素被打破致使腸道菌群發(fā)生紊亂時，人體就可能患上諸如肥胖癥、糖尿病、腸炎甚至癌癥等疾病。
隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，已解決了不可培養(yǎng)微生物研究的難題，使得腸道微生物的研究進入一個新的階段，NGS高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究者可以基于16S rDNA/18S rDNA基因，利用二代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)（454 GS FLX，Illimina HiSeq、MiSeq），獲得龐大的數(shù)據(jù)信息，通過生物信息學手段，來分析腸道微生物的多樣性，通過統(tǒng)計分析，對大量數(shù)據(jù)進行PCA和PCoA分析，得出發(fā)病前后樣本間腸道微生物主要組成成分是否存在差異；并進一步通過RDA分析，找到與環(huán)境因子（疾病等）相關(guān)的微生物群落組成，從而達到預防疾病的發(fā)生的目的。
研究案例：
1、結(jié)直腸癌與腸道微生物
Tingting Wang等采用454測序技術(shù)研究結(jié)直腸癌（CRC）患者與正常人群腸道微生物的菌落組成差異。并結(jié)合real-time PCR對相關(guān)基因進行分析，最終確定丁酸鹽產(chǎn)生菌的減少和一些致病微生物的增加使得CRC患者腸道微生物菌落的失衡。
研究對象： CRC患者46人，健康人群56人
研究區(qū)域：V3區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）PCA主成分分析（圖a）和PCoA主坐標分析（圖b）顯示CRC患者與正常人腸道微生物存在差異。藍色圓圈代表正常人，紅色圓圈代表CRC患者
（2）對CRC患者與正常人樣本在98%相似水平上OTU的相對豐度進行RDA分析，找到健康人群與CRC疾病患者相關(guān)的微生物類群，進行分析與CRC疾病相關(guān)的主要微生物類群。有48個OTU可以作一個關(guān)鍵變量與CRC患者和正常人腸道微生物結(jié)構(gòu)差異存在顯著相關(guān)性。
（3）Heatmap分析：48個OTU的相對豐度作為健康人和CRC患者腸道微生物差異的主要變量，他們在樣本中的分布情況見下圖。圖左側(cè)黑色OTU代表在正常人中相對豐富，紅色OTU代表在CRC患者中相對豐富，每個樣本的顏色強度代表在所有樣本中的相對比率。
2、二型糖尿病與腸道微生物
Larsen等研究二型糖尿病患者腸道微生物與非糖尿病人群的差異，采用454測序技術(shù)結(jié)合qPCR技術(shù)對36個樣本腸道微生物進行分析，結(jié)果表明二型糖尿病患者厚壁菌門和唆菌綱微生物比例較對照組顯著降低，但是變形菌綱微生物豐富。Bacteroidetes與Firmicutes的比例、Bacteroides-Prevotella group 與 C. coccoides-E. rectale group的比例與血糖濃度呈正相關(guān)，而與BMI（體重系數(shù)）無關(guān)。變形菌綱微生物同樣與血糖濃度呈正相關(guān)。
研究對象： 二型糖尿病患者18人，正常人18人
研究區(qū)域：V4-V6區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）Rarefaction Curve：確定取樣深度是否合理。
(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者與正常人腸道微生物在門與綱水平的差異。
3 飲食與腸道微生物
為了研究飲食對腸道微生物群落多樣性的影響，F(xiàn)ilippo CD等人比較了15個健康歐洲孩子（EU）及14個健康非洲農(nóng)村孩子（BF）腸道微生物群落的組成。EU的飲食具有典型的西方特色，而BF的食物則能代表傳統(tǒng)的非洲鄉(xiāng)下的飲食構(gòu)成。研究人員通過PCR擴增29個糞便樣品進行高通量測序。RDP數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示94.2%的reads屬于放線菌門（Actinobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes），壁厚菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria），然而它們在EU和BF中的比例具有顯著差異。BF腸道中擬桿菌占大部分，而壁厚菌所占比例較低。有趣的是，含有大量纖維素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例較高。
研究區(qū)域：V5-V6區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
EU（健康歐洲孩子）和BF（健康非洲農(nóng)村孩子）樣本中微生物分布統(tǒng)計
A：BF樣本中主要微生物的分布統(tǒng)計；B：EU樣本中主要微生物的分布統(tǒng)計；
C：全部樣本相似性分析；D：各樣本中主要微生物相對豐度統(tǒng)計；
E：各樣本中革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的相對豐度統(tǒng)計
4 肥胖與腸道微生物
Turnbaugh PJ等人對胖瘦不同的同卵雙胞胎（31對）、異卵雙胞胎（23對）及其母親（46個）共154個個體的腸道微生物進行了研究。結(jié)果表明肥胖與腸道門級微生物的變化相關(guān)，胖人與瘦人相比，微生物多樣性明顯降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）所占比例較低而放線菌門（Actinobacteria）所占比例較高。
A core gut microbiome in obese and lean twins. 2009. Nature.
研究區(qū)域：V2和V6區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
（1）A：不同胖瘦程度個體中主要門級別微生物分布及樣本之間相似性水平分析；
B：第一主成分與主要擬桿菌門（Bacteroidetes）的相關(guān)性分析；
C：雙胞胎之間，雙胞胎與母親，不相關(guān)個體之間微生物功能相似性分析。
（2）根據(jù)隨機序列取樣與物種多樣性分析圖顯示：肥胖人較瘦人體內(nèi)微生物多樣性顯著降低。
5 不同個體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)
人體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在嬰幼兒、成年人和老年人這三類人群中具有顯著的差異，這表明隨著年齡的增長，腸道菌群也歷經(jīng)了巨大的變化。Claesson MJ等人收集了161位65歲以上老人及9位成年人腸道菌群的樣品，進行焦磷酸測序。研究發(fā)現(xiàn)68%的個體腸道中最優(yōu)勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes），平均比例約為57%，壁厚菌門（Firmicutes）所占比例約為40%。但是和一些疾病或健康相關(guān)的菌群在不同個體中所占比例差別極大，包括變形桿菌門（Proteobacteria）,放線菌門（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物組與年青人也有鮮明差異，前者擬桿菌屬所占比例更大，梭菌屬在兩者之間具有不同的豐度模式。分析26組time-0和time-3 month糞便樣品，發(fā)現(xiàn)85%的個體在這兩個時間的微生物組成極其相近，這表明老年人的腸道菌群呈現(xiàn)出時間穩(wěn)定性。
研究區(qū)域：V4區(qū)
測序平臺：Roche 454 GS FLX
主要結(jié)果：
A：本研究老年人與青年人糞便中核心微生物在門、屬、梭菌屬的豐度統(tǒng)計（與以往研究者研究成果）；
B：本研究老年人糞便中unique微生物與5個數(shù)據(jù)庫青年個體中unique微生物在門、屬、梭菌屬的豐度統(tǒng)計；
C：本研究中老年人、青年人unique微生物在門、屬、梭菌屬的豐度統(tǒng)計。
test不同個體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不同個體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不同個體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)