1  基本概念

2  血液微生物組樣本采集方法與注意事項(xiàng)

2.1全血取樣：研究血液微生物多樣性的首選

全血樣本可完整保留血漿、紅細(xì)胞、白細(xì)胞等各組分中的微生物及其遺傳物質(zhì)，是全面分析血液微生物群落的核心選擇。經(jīng)優(yōu)化檢測(cè)流程處理后，微生物檢出效率與紅細(xì)胞層/血細(xì)胞層樣本一致性達(dá)98%以上，且無(wú)需額外離心分層，操作簡(jiǎn)單，污染風(fēng)險(xiǎn)低。

2.1.1全血樣本采樣步驟

采樣前準(zhǔn)備：選擇符合實(shí)驗(yàn)條件的受試者，告知實(shí)驗(yàn)相關(guān)信息并簽署知情同意書；準(zhǔn)備EDTA或肝素抗凝采血管、一次性采血針、無(wú)菌注射器、冰浴設(shè)備等，確保所有耗材無(wú)菌。

采集操作：采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或進(jìn)口離心管中（提前添加抗凝劑）。輕輕顛倒搖晃混勻（不可劇烈搖晃，以防溶血）。

 

2.2血液中不同組分的取樣：針對(duì)性研究特定微生物群落

若需聚焦特定血液組分中的微生物，可采集全血后在實(shí)驗(yàn)室規(guī)范離心分層，再選取目標(biāo)組分檢測(cè)。建議先采集全血，再進(jìn)行離心處理，既滿足分層樣本需求，又可保留全血樣本以備復(fù)檢或其他檢測(cè)。

血漿：微生物含量極低（僅占0.03%），聚焦細(xì)胞游離微生物DNA（cfmDNA），適用于感染早期診斷、疾病相關(guān)微生物標(biāo)志物篩選等研究。

Buffy 層（白細(xì)胞層）：微生物DNA含量最豐富，適用于高靈敏度微生物DNA檢測(cè)，尤其適合研究胞內(nèi)寄生微生物及極低豐度的微生物。

紅細(xì)胞層：含少量微生物DNA，適合分析紅細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，避免溶血影響核酸提取效率。

2.2.1分層樣本采樣步驟

采樣前準(zhǔn)備：與全血采樣一致，需額外準(zhǔn)備低溫離心機(jī)、無(wú)菌離心管等設(shè)備。

全血采集：采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或進(jìn)口離心管中（提前添加抗凝劑），輕輕顛倒搖晃混勻（不可劇烈搖晃，以防溶血），4℃或冰浴靜置約10min，先低溫低速離心（3000rpm，10min，4℃），使血液分為血漿層（上層）、白細(xì)胞和血小板層（中層）、紅細(xì)胞層（下層）。用無(wú)菌移液器或吸管分別吸取目標(biāo)組分。

2.3注意事項(xiàng)

a）不要使用無(wú)抗凝劑的采血管（凝血后，微生物基因組提取變得非常困難）。

b）采血過(guò)程需等消毒劑（乙醇、異丙醇等）完全揮發(fā)后采樣。

c）采集過(guò)程中，樣品放置時(shí)間，離心時(shí)間、等保持一致。

d）紅細(xì)胞/血細(xì)胞層得率約50%，1mL外周血可得約0.5mL血細(xì)胞層。

e) 樣本按500μL/支分裝，方便后繼需要多次檢測(cè)，盡量避免樣本多次凍融。

f）血細(xì)胞層如發(fā)生溶血（凍存前或凍存后），只要不凝塊，不影響微生物基因組DNA提取。

3  血液代謝組樣本采集方法與注意事項(xiàng)

3.1 血漿樣本代謝組檢測(cè) 

3.1.1 采集步驟

采集2-5mL外周血于抗凝采血管中或進(jìn)口離心管中（需提前添抗凝劑），輕輕顛倒搖晃混勻（不可劇烈搖晃，以防溶血），4℃或冰浴靜置約10min，先低溫低速離心（3000rpm， 10min，4℃），取大部分上層血漿，200μL分裝到潔凈螺口管中，液氮速凍15min（可省略）。

3.1.2注意事項(xiàng)

a) LC-MS平臺(tái)推薦使用肝素鈉/EDTA 抗凝，NMR平臺(tái)推薦使用肝素鈉抗凝；血漿樣品不推薦使用檸檬酸做抗凝劑，因?yàn)闄幟仕崾?/span>TCA循環(huán)中的重要物質(zhì)，使用檸檬酸鈉抗凝劑會(huì)引入外源污染。而EDTA會(huì)影響NMR采譜。需注意肝素鈉會(huì)對(duì)RNA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)有負(fù)面作用，主要是因?yàn)闀?huì)抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性。請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適抗凝管。

b）采血過(guò)程需等消毒劑（乙醇、異丙醇等）完全揮發(fā)后采樣。

c）采集過(guò)程中，樣品放置時(shí)間，離心時(shí)間等保持一致。

d）分裝使用的離心管盡可能使用低吸附離心管。

e）血漿得率約50%，1mL外周血可得約0.5mL血漿。

f) 樣本按200μL/支分裝，是方便后繼需要多次檢測(cè)，應(yīng)盡量避免樣本多次凍融情況。

3.2血清樣本代謝組檢測(cè)

3.2.1 采集步驟

采集2-5mL外周血于無(wú)任何添加劑的采血管或進(jìn)口離心管中，輕輕顛倒搖晃混勻（不可劇烈搖晃，以防溶血），4℃或冰浴靜置約1h（確認(rèn)凝集出血塊），先低溫低速離心（3000rpm，10min，4℃）；取大部分上層血清，將上述血清按200μL/支，分裝至螺口管中，液氮速凍15min（可省略）。如血清量不夠，可再次高速離心（12000rpm，10min，4℃），取剩余少量上層血清，如發(fā)生溶血，則不可再取/用。

3.2.2 注意事項(xiàng)

a）血清樣品推薦使用無(wú)采任何添加劑的采血管（不用有促凝劑的采血管）。

b）采血過(guò)程需等消毒劑（乙醇、異丙醇等）完全揮發(fā)后采樣。

c）采集過(guò)程中，樣品放置時(shí)間，離心時(shí)間等保持一致。

d）血清得率約30-50%，1mL外周血可得約0.3-0.5mL血清。

e) 樣本按200μL/支分裝，是方便后繼需要多次檢測(cè)，應(yīng)盡量避免樣本多次凍融情況。

4 推薦采樣量

5  樣本的保存和寄送

短期保存（≤24小時(shí)）：采集后立即置于4℃冷藏保存，避免室溫放置超過(guò)4小時(shí)。分層樣本需單獨(dú)密封保存，防止交叉污染，尤其血漿樣本需避免與細(xì)胞組分接觸導(dǎo)致游離DNA降解。

長(zhǎng)期保存（>24 小時(shí)）：樣本按對(duì)應(yīng)分裝標(biāo)準(zhǔn)分裝入潔凈螺口管，避免反復(fù)凍融。-80℃冰箱可保存6-12個(gè)月，-20℃冰箱可短期保存1-3個(gè)月。

特殊注意事項(xiàng)：

需保留微生物活性或進(jìn)行微生物培養(yǎng)的樣本，必須使用抗凝劑防止凝固，存放于室溫或4℃冰箱，且需盡快開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，不宜長(zhǎng)期存放。

冷凍后的全血樣本解凍后，輕微溶血可正常檢測(cè)；嚴(yán)重溶血（血液呈醬油色）需重新采集，避免血紅蛋白干擾核酸提取。

若無(wú)法實(shí)現(xiàn)低溫保存，可使用微基生物研發(fā)的微生物DNA常溫采集保存套裝，樣本可在常溫下穩(wěn)定保存14天。 

 

6  附（抗凝管的種類和顏色）

提示：血液樣本的代謝組學(xué)檢測(cè)，采血管只接收紅蓋（無(wú)添加），綠蓋（添加肝素鈉），紫蓋（添加EDTA）。禁用PAXgene管，添加促凝劑的紅蓋管等。

 

7 常見(jiàn)問(wèn)題解答

1）全血樣本與分層樣本的檢測(cè)結(jié)果有差異嗎？

無(wú)顯著差異，全血樣本經(jīng)優(yōu)化檢測(cè)流程后，微生物檢出效率與紅細(xì)胞層/血細(xì)胞層樣本一致性達(dá)98%以上，不影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2）忘記加抗凝劑的全血樣本還能檢測(cè)嗎？

不可檢測(cè)。未抗凝的血液會(huì)發(fā)生凝固，導(dǎo)致細(xì)胞裂解和微生物失活，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。

3）全血樣本可以檢測(cè)哪些微生物？

適用于檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、非典型病原體等多種微生物。全血mNGS技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)千種微生物，提高了檢測(cè)的全面性。

4）采血量對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響嗎？

有影響，采血量直接影響檢測(cè)的靈敏度。推薦按標(biāo)準(zhǔn)采血量采集，采血量不足會(huì)降低微生物檢出率。

5）可以使用不同類型的抗凝劑嗎？

推薦使用EDTA抗凝劑；肝素抗凝劑也可使用，但需注意其可能抑制某些PCR反應(yīng)；不推薦使用枸櫞酸鈉抗凝劑。

6）可以檢測(cè)到所有病原體嗎？

目前沒(méi)有任何一種方法可以檢測(cè)到所有病原體。不同檢測(cè)方法各有優(yōu)劣，微基生物可根據(jù)您的臨床需求選擇合適方法，必要時(shí)聯(lián)合多種方法提高檢出率。