微基生物 您自己的微生態(tài)研究團隊|專注微生態(tài)研究與應用
抗性基因即抗性的遺傳因子，是選擇基因的一種。目前由于大量抗生素在人類醫(yī)藥業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)濫用，導致了人體或動物體內抗生素抗性基因(ARGs)的產生，不可避免的導致耐藥微生物和抗性基因的增加和擴散，引起一系列污染和生態(tài)風險。作為21世紀一類新興污染物，抗性基因的污染水平已經遠遠超過我們的預想。因此對人體、土壤等樣本中抗性基因的分布水平、擴散傳播及消減技術的研究，刻不容緩。微基生物可以提供抗性基因的定量檢測服務。
1 檢測樣本
糞便、水樣、土壤、霧霾、細菌等
若客戶提供DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據進行轉化。
2 檢測平臺
qPCR定量檢測平臺，能夠檢測300多種抗生素抗性基因。
3 檢測服務
絕對定量檢測服務：
是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構建標準曲線對未知模板進行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。
相對定量檢測：
測定目的基因在樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的絕對拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計算。
4 檢測方法
SYBRGreenⅠ法：
嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后構象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
TaqMan探針法：
擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步
5 qPCR的實驗流程
6 部分基因列表如下：
| Gene | Classification | Mechanism |
| catA1、catB3、cfr等 | (flor)/(chlor)/(am)phenicol | deactivate |
| cmlA1、cmx(A)、floR等 | efflux | |
| qnrA等 | unknown | |
| aac、aacA/aphD、aacC、aacC1、aacC2、aacC4、aadA、aadD、aadE、aph、aph6ia、aphA1(akakanR)、spcN-01、spcN-02、str、strA、strB等 | Aminoglycosides | deactivate |
| ampC/blaDHA、ampC、bla1、blaCMY、blaCTX、blaGES、bla-L1、blaMOX/blaCMY、blaOCH、blaOKP、blaOXA1/blaOXA30、blaOXY、blaPAO、blaPER、blaPSE、blaROB、blaSFO、blaSHV-01、blaTEM、blaTLA、blaVEB、blaVIM、blaZ、cepA、cfiA、cfxA、cphA、fox5、NDM1、ampC等 | Beta_Lactamas | deactivate |
| mecA、pbp、pbp2x、Pbp5、penA等 | Beta_Lactamas | protection |
| int等 | MGEs | integrase |
| IS613、tnpA、Tp614等 | transposase | |
| ereB、lnuA、lnuB、lnuC、mphA、mphB、mphC、vatB、vatC、vatE、vgb、vgbB等 | MLSB | deactivate |
| carB、ImrA、matA/mel、mdtA、mefA、msrC、oleC、vgaA、vgbB、msrA等 | efflux | |
| erm、ermA、ermA/ermTR、ermB、ermC、ermF、ermJ/ermD、ermK、ermT、ermX、ermY等 | protection | |
| acrA、adeA、acrF、ceoA、cmeA、cmr、marR、mdetl1、mdtE/yhiU、mepA、mexA、mexD、mexE、mexF、mtrC、mtrD、oprD、oprJ、pmrA、qac、qacA、qacA/qacB、qacH、rarD、sdeB、tolC、ttgB、yceE/mdtG、yceL/mdtH、yidY/mdtL、ttgA、emrD等 | Multidrug | efflux |
| fabK、bacA、bacA、fosB、fosX、sat4等 | other | deactivate |
| imiR、nisB等 | unknown | |
| dfrA、folA等 | Sulfonamides | deactivate |
| sul等 | protection | |
| tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetPA、tet、tetV等 | Tetracyclines | efflux |
| tet(32)、tet(36)、tet(36)、tetM、tetO、tetW、tetPB、tetS、tetT、tetQ等 | protection | |
| tet(34)、tet(37)、tetU-01、tetX、tet(35)等 | unknown | |
| vanA、vanB、vanC、vanG、vanHB、vanHD、vanRA、vanRB、vanRC、vanRD、vanSA、vanSB、vanSC、vanTC、vanTE、vanTG、vanWB、vanWG、vanXA、vanXB、vanXD、vanYB、vanYD等 | Vancomycin | protection |
7 qPCR檢測送樣要求
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 環(huán)境 | 土壤/沉積物/淤泥 | 1g | |
| 湖水/海水/河水 | 1L，用濾膜或離心富集 | 過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進行富集。 | |
| 污水 | 20ml | 若樣本清亮則可適當?shù)囟嗳 ? | |
| 泥水混合樣 | 2ml | ||
| 空氣 | 根據實驗需要，用無菌濾膜過濾空氣。 | ||
| 發(fā)酵物 | 固體 2g，液體 20ml |
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 人體 | 糞便 | ≥3g | |
| 皮膚 | 5 個采集拭子 | 采集 5cm*5cm 面積，反復刮取 20 次。 | |
| 生殖道 | 5 個采集拭子 | 采集陰道口內 4cm 處分泌物， 每個拭子轉 3 圈。 | |
| 牙菌斑/舌苔 | 5 個采集拭子 | 在采集的部位，刮取 10 次左右。 | |
| 唾液 | 10ml | ||
| 痰液 | 10ml 或 2-3 口痰液 | ||
| 鼻腔 | 5 個采集拭子 | 采集鼻腔內粘膜上的分泌物，轉 3 圈。 | |
| 肺部灌洗液 | 30ml 富集液 | 對灌洗液進行離心富集。 | |
| 腸道/胃組織 |
5mm*5mm*3mm 3 塊 |
盡量多一取些。 | |
| 血液 | 3ml 全血 | 用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。 | |
| 尿液 | 30mL 尿液 | 取中段尿為宜。 | |
| 母乳 | 5mL | ||
| 動物 | 糞便 | ≥3g | 最少 0.05g。 |
|
盲腸/結腸/胃 組織 |
≥3g | 至少 1g，如果實驗條件允許，盡可能多的收集樣本 | |
| 腸道內容物 | ≥3g | 最少 0.05g。建議客戶自己取內容物，可以用 PBS 沖洗。 |
提醒
1 因為qPCR絕對定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據進行轉化。
2 送樣時請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒
8 qPCR結果展示
標準曲線
擴增曲線
熔解曲線
定量結果
| 微基編號 | 拷貝數(shù) | 樣本稀釋倍數(shù) | 抽提樣本重量（g） | 基因組DNA體積（μL） | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本 | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本 |
| 1 | 1.08E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.17E+08 | 2.26E+08 | 4.58E+10 | 4.76E+10 |
| 1 | 1.23E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.47E+08 | 5.20E+10 | ||
| 1 | 1.07E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.14E+08 | 4.51E+10 | ||
| 2 | 7.28E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.46E+08 | 1.49E+08 | 3.03E+10 | 3.09E+10 |
| 2 | 7.55E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.51E+08 | 3.15E+10 | ||
| 2 | 7.44E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.49E+08 | 3.10E+10 | ||
| 3 | 1.24E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.48E+08 | 2.59E+08 | 4.96E+10 | 5.19E+10 |
| 3 | 1.35E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.69E+08 | 5.39E+10 | ||
| 3 | 1.30E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.61E+08 | 5.21E+10 | ||
| 4 | 1.61E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.21E+08 | 3.22E+08 | 6.87E+10 | 6.87E+10 |
| 4 | 1.60E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.19E+08 | 6.82E+10 | ||
| 4 | 1.62E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.24E+08 | 6.93E+10 | ||
| 5 | 1.27E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.54E+07 | 2.66E+07 | 7.25E+09 | 7.59E+09 |
| 5 | 1.33E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.66E+07 | 7.61E+09 | ||
| 5 | 1.39E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.77E+07 | 7.91E+09 |
9 參考文獻
1ujin gDuan et.al. Gut resistomes, microbiota and antibiotic residues in Chinese patients undergoing antibiotic administration and healthyindividuals.2020. Science of the Total Environment.（研究中國健康人和患者）
抗生素濃度與ARG總豐度呈正相關，與ARG總豐度呈負相關ARGs和細菌群落的多樣性，這表明抗生素的使用可以形成抗生素耐藥性和腸道細菌群落。cfxA基因作為一種潛在的生物標志物，以區(qū)分在中國廣泛接受抗生素治療的患者和健康的個人在患者的腸道中檢測并顯著富集。
2JieFenget.al.Antibiotic Resistome in alarge-scale healthy human gut microbiota deciphered by metagenomic and network analyses.2017.Environmental microbiology.（不同國家的腸道微生物抗性基因分析）
中國人的腸道樣本中ermF、ermB、cfxA、tetQ的顯著富集，高于瑞典，可作為中國人中潛在的生物標志物。
