做微生物多樣性研究時(shí)，大家是不是經(jīng)常會遇到RDA分析、CCA分析、PCA分析、PCoA分析呀？我們知道它們對物種（基因或功能）的分析具有重要的作用。但是你知道它們代表什么意思？在什么情況下用什么分析嗎？

　　近期小編將把這一堆的分析給大家逐個(gè)講解，今天咱們首先從RDA分析入手！

　?。ㄆ鋵?shí)上面所提到的分析，本質(zhì)上都屬于排序分析。排序就是在一個(gè)可視化的低維空間(通常是二維)重新排列這些樣方，使得樣方之間的距離最大程度地反映出平面散點(diǎn)圖內(nèi)樣方之間的關(guān)系信息。）

　　RDA分析其實(shí)是小名，它的中文名叫冗余分析，還有個(gè)洋氣的英文名叫Redundancy Analysis，RDA分析可以將樣本和環(huán)境因子反映在同一個(gè)二維排序圖上，從圖中可以直觀地看出樣本分布和環(huán)境因子間的關(guān)系。

比如下面這張由微基自己完成的圖

小編和大家一起來“破解”這張RDA圖

（1）在這個(gè)圖中，箭頭表示環(huán)境因子。

（2）箭頭連線的長度表示該環(huán)境因子與樣本分布間相關(guān)程度的大小，連線越長，相關(guān)性越大，反之越小。

（3）箭頭連線和排序軸的夾角以及箭頭連線之間的夾角表示相關(guān)性，銳角表示成正相關(guān)關(guān)系，鈍角則表示成反相關(guān)關(guān)系。夾角越小，相關(guān)性越高。

（4）箭頭所指方向表示群落分析指標(biāo)或環(huán)境因子的變化趨勢。

　　其實(shí)從RDA報(bào)告中，還可以看出所有環(huán)境因子或某個(gè)環(huán)境因子對樣本的影響，不過由于分析報(bào)告“太瑣碎”，通常在文獻(xiàn)中不會出現(xiàn)，如下圖在這個(gè)報(bào)告中，紅色標(biāo)注內(nèi)表示所有環(huán)境因子對樣本變化的整體解釋量，綠色標(biāo)注內(nèi)則分別表示3個(gè)軸具體的解釋量。

那怎么看某個(gè)環(huán)境因子對所有樣本的影響呢？這里小編再給大家舉個(gè)例子

　　在圖3中，將變量射線延長，樣本垂直投影于射線上，沿著變量箭頭方向，環(huán)境變量值增大。圖中樣本Sa3和Sa4所對應(yīng)的環(huán)境變量A值近似相等，A對所有樣本影響的大小排序?yàn)椋篠a1>Sa4≈Sa3>Sa2>Sa5

　　看到這里是不是覺得RDA分析圖很強(qiáng)大？！想不想自己動手操作一下？！小編悄悄的告訴你RDA分析圖可以用許多軟件做，如CANNOCO、R語言的Vegan。

　　另外小編再告訴大家一個(gè)秘籍，在做RDA分析時(shí)，環(huán)境因子的個(gè)數(shù)要小于物種的個(gè)數(shù)，否則軟件會“罷工”！

（轉(zhuǎn)載請注明出處）

　　如果您對微生態(tài)研究方法有比較感興趣的話題和生物信息學(xué)相關(guān)興趣，歡迎聯(lián)系我們，對于反饋較多的問題，我們將優(yōu)先推出相關(guān)內(nèi)容和問題解答。您可以關(guān)注我們的微信號，給我們發(fā)微信或電子郵件：

support@tinygene.com

期待您的來電：400-660-9270

生物信息分析之RDA分析_微基生物，首發(fā)于微基生物。

DGGE作為一種成熟的分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、醫(yī)學(xué)（各種疾病治療前后，病變部位微生物的差異）、人體（鼻咽、口腔、黏膜、腸道）等領(lǐng)域進(jìn)行微生物多樣性分析。

實(shí)驗(yàn)流程圖：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括以下內(nèi)容

1 引物設(shè)計(jì)

以下是DGGE中常用的引物，我們將根據(jù)客戶的不同需求，進(jìn)行針對性的引物設(shè)計(jì)。

2 基因組DNA抽提電泳檢測圖

針對客戶的樣本來源不同，我們針對性優(yōu)化不同的基因組抽提方法，已達(dá)到提取效果最佳。

　　說明：1-8為樣本所抽提基因組DNA，上樣量3uL；M為1kb Marker上數(shù)第一條帶為8 kb，中間的亮帶為3kb，濃度為30ng/uL，其余為10 ng/uL。

3 目的片段PCR檢測

　　說明：1-8為樣本，負(fù)為負(fù)對照（說明我們的實(shí)驗(yàn)沒有污染，這對分子實(shí)驗(yàn)是至關(guān)重要的），上樣量為5uL；M為DL2000 Marker，上樣量3uL。其中亮帶為20ng/uL，其余為10 ng/uL。
Reconditioning PCR：

　　第一輪PCR產(chǎn)物將會作為新的模板再進(jìn)行少數(shù)循環(huán)的第二輪PCR擴(kuò)增，這叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的過程中引物和模板之間的比例始終保持在較高的水平上，因此可以保證引物與模板之間的退火要優(yōu)先于不同模板之間的退火，消除異源雙鏈（Heteroduplex）污染對于PCR-DGGE圖譜的觀察和分析。

參考文獻(xiàn)：
　　(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.
　　(2)不同外源擾動因素對腸道菌群組成結(jié)構(gòu)影響的研究. 上海交通大學(xué) 2008 屆博士學(xué)位論文.

4 DGGE圖譜分析

　　4.1 DGGE膠圖和條形圖
?
　　4.2 戴斯相似性系數(shù)

?圖注：lane:代表樣品編號

　　4.3微生物多樣性指數(shù)

4.4 UPGAM法進(jìn)行樣品間的聚類分析圖

　　常見聚類分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s
　　4.5微生物群落的多維定標(biāo)分析

　　4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）

　　4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）

5 .主要膠條進(jìn)行割膠

6 割膠條帶的DNA回收、二擴(kuò)及TA克隆

6.1 二擴(kuò)電泳檢測
　　分別取5 μL PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如下圖所示

　　電泳檢測結(jié)果顯示：PCR產(chǎn)物條帶單一，片段大小正確，可進(jìn)行膠回收。
6.2 膠回收
　　采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收 PCR 產(chǎn)物，取3 μL回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。
6.3 TA連接及轉(zhuǎn)化
　　PCR產(chǎn)物的克隆使用 BioLinker的pED-T載體試劑盒。
6.4 陽性克隆的篩選及測序
　　在平板上隨機(jī)挑取8個(gè)克隆搖菌，菌液進(jìn)行M13檢測，挑取3個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序。

7 測序結(jié)果匯總

7.1 fasta文件
　　全部測序結(jié)果進(jìn)行整理，去除載體序列，將其整理為fasta格式的序列文件，為后續(xù)分析做準(zhǔn)備。

7.2克隆子一致性分析（Alignment比對）

一般每個(gè)條帶送三個(gè)克隆子進(jìn)行測序，那么三個(gè)克隆子所測序列的一致性如何，我們通過clonemanager軟件進(jìn)行序列性的分析，如果克隆子的測序結(jié)果完全一致，那么會以綠色的覆蓋形式表示，若是序列不一致，會是白色區(qū)域。如下圖所示：

7.3測序結(jié)果NCBI的Blast比對匯總表

7.4測序結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

?DGGE技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：1. 高效，理論上可以分離開一個(gè)堿基差異的DNA片段。
　　　2. 方便，不用對樣品進(jìn)行標(biāo)記
　　　3. 快速，對于已知DGGE條件的樣品，可在短時(shí)間能獲取DGGE圖譜
　　　4. 直觀，DGGE圖譜可直觀的反應(yīng)出樣品中個(gè)組分的豐富度
　　　5. 穩(wěn)定，DGGE作為一種成熟的技術(shù)，可重復(fù)性高
　　　6. 可多樣本同時(shí)分析，展現(xiàn)各樣本的差異
缺點(diǎn)：1. 僅能檢測樣本中的主要微生物，占總量1%以上的微生物才能被檢測到。
　　　2. DGGE只能對200-700bp的片段有效地分離，過大或者過小的片段分離效果都不是很好。
　　　3. 因?yàn)閮x器數(shù)值有上限，對于某些某種主要菌株占比較大又要展現(xiàn)大部分條帶的樣品，通過DGGE圖譜不能很好的反映出各個(gè)菌株的豐富度。
　　　4. 不同序列的DNA有可能發(fā)生共遷移而導(dǎo)致某些條帶會有多種不同的DNA片段
　　　5. 因?yàn)槟承┪锓N的基因不同拷貝之間存在異質(zhì)性，即使一個(gè)堿基的差別都會使他們分開，而導(dǎo)致不同的條帶是相同物種。
　　　6. DGGE技術(shù)對微生物的分類鑒定依賴于基因數(shù)據(jù)庫,若數(shù)據(jù)庫中基因序列信息不夠豐富,將會限制DGGE的使用。
　　　7. 由于某些種類的16S rDNA不同拷貝之間的多態(tài)性問題,可能導(dǎo)致自然群落中細(xì)菌數(shù)量的過多估計(jì)。

送樣要求

1 、環(huán)境樣品基因組DNA

　　1） 請?zhí)峁舛却笥?0ng/uL，總量大于500ng的基因組DNA，DNA純度較差或降解嚴(yán)重會影響后繼的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。如果方便的話，可提供電子版DNA電泳檢測照片及OD260/280比值。
　　2） 樣品在保存期間避免反復(fù)凍融。
　　3） 送樣務(wù)必標(biāo)清楚樣品編號，并用parafilm膜對管口進(jìn)行密封。
　　4）請務(wù)必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。

2、 環(huán)境樣品

　　1）送樣樣品盡量保證新鮮，為了防止微生物死亡或DNA降解，采樣后建議立即冰凍保存，如樣本極為珍貴，建議采用液氮速凍后-80℃冰箱保存。
　　2）樣品在保存期間避免反復(fù)凍融。
　　3）若是樣品中含有大量的腐殖質(zhì)酸、重金屬等PCR反應(yīng)抑制劑，請?jiān)谒蜆訒r(shí)注明。
　　4）請務(wù)必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。
送樣條件：
以上兩種類型的樣本，送樣時(shí)采用干冰保存運(yùn)輸；若是距離較遠(yuǎn)，建議采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

3、各類未抽提基因組樣品的送樣量：

　　土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、農(nóng)田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
　　糞便：3-5 g
　　腸道內(nèi)容物：3-5 g
　　動物組織：3-5g（鰓、胃粘膜、腸粘膜、口腔黏膜等）
　　分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、淚水等）
　　水樣：2L以上水過濾后的濾膜，若環(huán)境中微生物豐富，可適當(dāng)減少水的體積。
　　植物內(nèi)生菌：10-20g葉片；3-5g根系。
　　血液：10mL。
　　葉片：50-100g
　　其他來源的樣品請垂詢：400-660-9270或郵件：support@tinygene.com,我們會在第一時(shí)間回復(fù)您！
　　以上用PP材料的epp管或螺口管盛裝即可。

PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳），首發(fā)于微基生物。

RDA分析，即冗余分析，對比主成分分析可以發(fā)現(xiàn)，其實(shí)冗余分析就是約束化的主成分分析。PCA和RDA的目的都是尋找新的變量來代替原來變量，它們主要區(qū)別在于后者樣方在排序圖中的坐標(biāo)是環(huán)境因子的線性組合。它的優(yōu)點(diǎn)就是考慮了環(huán)境因子對樣方的影響，因?yàn)橛行r(shí)候我們想得到在某些特定條件限制下（如海拔高度，PH值，酸堿度，疾病組與健康組等）物種的分布?？梢缘玫侥男┪锓N受特定的環(huán)境因子影響?？梢缘玫饺缒承┲脖皇鞘芎０胃叨扔绊懀承┚躊H值或酸堿度的影響等。

對數(shù)據(jù)的準(zhǔn)備，需要兩個(gè)矩陣，一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，一個(gè)環(huán)境矩陣，數(shù)據(jù)矩陣和pca準(zhǔn)備數(shù)據(jù)相同，環(huán)境矩陣形式如下，如果有不能量化的環(huán)境因子（如性別，疾病與健康等）聯(lián)系我們，來量化您的數(shù)據(jù)。

對數(shù)據(jù)的要求，樣方的個(gè)數(shù)必須大于環(huán)境因子的個(gè)數(shù)。

RDA分析(Redundancy analysis)，首發(fā)于微基生物。