微基生物采用高通量測序、PCR-DGGE、實時熒光定量PCR等方法，對樣本中的DNA進行序列測定，并通過生信統(tǒng)計分析，對大量數(shù)據(jù)進行處理，揭示腸道中微生物的種類以及它們之間的相對豐度和進化關(guān)系，探討微生物多樣性，研究根系微生物與環(huán)境間的相關(guān)關(guān)系。

技術(shù)路線：

高通量分析流程

PCR-DGGE分析流程

檢測平臺：

　　微基生物擁有Illumina MiSeq、Ion PGM、Roche 454高通量測序分析，PacBio第三代高通量測序分析，PCR-DGGE變性梯度凝膠分析，實時熒光定量PCR（Real-time qPCR），克隆文庫等檢測平臺。

樣品采集：

　　微基生物為客戶提供樣品采集的配套工具，如采集盒、保存液、取樣勺和保存管等。

送樣要求：

樣品原樣

　　(1)樣品類型：根系微生物，新鮮取樣，凍存于-80℃

　　(2)樣品需求：≥2g

　　(3)樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸

DNA類型

　　(1) 樣品類型： DNA

　　(2) 樣品需求量：≥300ng

　　(3) 樣品濃度： ≥10ng/μL

　　(4) 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無降解

　　(5) 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸

　　(6) 對于本種類型的樣品，我們在檢測完樣品的質(zhì)量后，進行PCR擴增等后續(xù)試驗

生物信息與統(tǒng)計學(xué)服務(wù)：

　　生信分析項目

　　更多微生態(tài)方向研究和生物信息方面服務(wù)，請詳詢：400-660-9270

標(biāo)題：運用PCR-DGGE和焦磷酸測序分析（Roche 454）對紅樹林濕地和根圍古菌的多樣性分析

研究領(lǐng)域：根系微生物

分析物種：古菌

研究區(qū)域：16S rRNA V4 and V5 regions

研究方法：PCR-DGGE和Roche 454

主要結(jié)果：

1. 實驗DGGE結(jié)果

　　2.兩個PCO軸和展示了所有數(shù)據(jù)集58%的變種，（根圍上、中、下古菌菌群的展示）

　　3.采用重測樣對16S rRNA的樣本寬度和樣本測序豐富度曲線

4.運用RDP的分類器算法統(tǒng)計出古菌16S rRNA在三個不同地方的差異

5.根際微生物中不同地方占主導(dǎo)地位OUT的相關(guān)關(guān)系

6.被檢索到的古菌序列的具體分類

原文鏈接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22660713

參考文獻：

Pires, A. C., D. F. Cleary, A. Almeida, A. Cunha, S. Dealtry, L. C. Mendonca-Hagler, K. Smalla and N. C. Gomes (2012). “Denaturing gradient gel electrophoresis and barcoded pyrosequencing reveal unprecedented archaeal diversity in mangrove sediment and rhizosphere samples.” Appl Environ Microbiol 78(16): 5520-5528.

根系微生物，首發(fā)于微基生物。

1、什么是OTU 、PCA、RDA？
　　答：OTU（Operational Taxonomic Units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。
　　PCA即主成分分析。將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。
　　 RDA即冗余分析，對比主成分分析可以發(fā)現(xiàn)，其實冗余分析就是約束化的主成分分析。

2、什么是Reads、Run、Barcode？
　　答：Reads: 高通量測序平臺產(chǎn)生的序列標(biāo)簽就稱為reads。
　　Run：指高通量測序平臺單次上機測序反應(yīng)。
　　Barcode：與Index同義，多指在Roche GS FLX 454測序平臺的16S PCR產(chǎn)物的測序過程中接頭序列所包含的的用來區(qū)分不同樣本的序列。

3、什么是高通量測序（NGS）？
　　答：高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)Sanger測序革命性的改變, 一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定, 因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細(xì)致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。

4、高通量測序平臺和DGGE分析環(huán)境微生物多樣性，它們之間的區(qū)別？
　　答：一般認(rèn)為土壤、海洋、腸道等生態(tài)系統(tǒng)中的微生物數(shù)量繁多、種類多樣。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法只限于對環(huán)境樣品中極少部分（0.1%-1%）可培養(yǎng)的微生物類群的研究。 DGGE技術(shù)操作復(fù)雜、成本高、痕量菌發(fā)現(xiàn)困難，在其實驗結(jié)果中往往只含有數(shù)十條條帶，只能反映出樣品中的優(yōu)勢種群，也無法得到細(xì)菌種類的絕對數(shù)量。而高通量測序技術(shù)能同時對樣品中的優(yōu)勢種群及微量的劣勢種群進行檢測，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進行數(shù)字化，而且每個樣品的測序量達到普通測序的幾百倍，而單條序列的測序費用遠(yuǎn)低于普通測序。

5、Misq平臺和羅氏454平臺之間的區(qū)別在于？
　　答：羅氏454高通量測序技術(shù)能同時對樣品中的優(yōu)勢物種、稀有物種及一些未知的物種進行檢測，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進行數(shù)字化。測序費用比較高，后期數(shù)據(jù)分析比較麻煩。MiSeq高通量測序平臺集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的優(yōu)點，不僅可實現(xiàn)對多樣品的多個可變區(qū)同時測序，而且在測序速度和測序通量上都有進一步提升，而且測序費用相對于羅氏454便宜很多，后繼分析沒有那么麻煩。

6、做高通量平臺分析整個實驗周期是多少天？
　　答：根據(jù)不同客戶的要求，實驗周期也不盡相同。我們在接到客戶提供的樣品后，即刻進行實驗，至全部實驗及數(shù)據(jù)分析結(jié)束，一般控制在40個工作日內(nèi)完成。

7、需要多少測序量？
　　答：由于不同環(huán)境樣品的物種成分、豐度都各不相同，所需的測序量也不一樣。我們會根據(jù)合作伙伴樣品的具體情況及研究目的，進行測序深度數(shù)據(jù)庫檢索，給合作伙伴提供合理建議。

8、測序條數(shù)？
　　答：我們保證單個樣本測序條數(shù)高于1.8萬條/樣本，樣本平均測序條數(shù)高于3萬條/樣本。同時可以按照客戶需求增加測序條數(shù)。

9、實驗結(jié)果含那些數(shù)據(jù)？
　　a. 匯總統(tǒng)計全部的測序結(jié)果。
　　b. 將全部序列進行比對，進行聚類/OTU劃分， 列出每個OTU的代表序列。
　　c. 種屬鑒定，與SILVA數(shù)據(jù)庫進行比對，判斷每類OTU詳細(xì)的分類信息。
　　d. 熱圖分析
　　e. PCA分析
　　f. 根據(jù)測序序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹分析。
　　h. VENN 圖
　　i. RDA 分析?

PCR-DGGE相關(guān)問題

1、什么是DGGE？
　　答：DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即變性梯度凝膠，是利用DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。

2.DGGE應(yīng)用領(lǐng)域
　　答：DGGE作為一種成熟的分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

3、是否可以參與實驗？
　　答：公司原則上不允許參與實驗的，可以參觀實驗室。

4、一板DGGE膠的樣品量？
　　答：DGGE膠板一般是16個孔，但是由于電泳過程中，膠兩側(cè)的電流會影響兩邊的電泳效果，導(dǎo)致條帶扭曲。為了保證后記實驗分析的準(zhǔn)確性，建議在12個樣品以內(nèi)。

5、樣品能否返還？
　　答：根據(jù)客戶的需求，如果需要返還，由公司工作人員聯(lián)系客戶后寄送。如果不需要返還，我們會在實驗完成后60天后將樣品進行銷毀處理。

6、實驗周期？
　　答：根據(jù)不同客戶的要求，實驗周期也不盡相同。我們在接到客戶提供的樣品后，即刻進行實驗，至全部實驗及數(shù)據(jù)分析結(jié)束，一般控制在40個工作日內(nèi)完成。

7、DGGE分析原核微生物多樣性，主要分析哪些區(qū)域？選擇區(qū)域的依據(jù)是什么?
　　答：公司針對原核微生物的9個高變區(qū)域都進行過多樣性分析，目前客戶做的最多的還是V1-V3區(qū)域。我們可以根據(jù)客戶的要求，選擇相應(yīng)的擴增區(qū)域。

8、真核微生物多樣性分析，主要做哪些區(qū)域？
　　答：真核生物主要是做V1-V3區(qū)域。真菌可以針對ITS1、ITS2進行分析。

9、克隆轉(zhuǎn)化能保證多少個有效的測序結(jié)果？
　　答：根據(jù)客戶的要求，每個條帶可以提供3個有效序列。

10、DGGE分析微生物群落要做平行樣嗎?
　　答：DGGE分析環(huán)境微生物多樣性，一般不需要做平行樣。

11、如何保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性？
　　答：我們在每一步實驗操作過程中都會防止各個樣品之間出現(xiàn)交叉污染的情況，從基因組DNA提取到最后的克隆轉(zhuǎn)化，我們都嚴(yán)格把關(guān)，確保每個數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和真實性。

12、如果實驗數(shù)據(jù)和預(yù)期不符，如何解決？
　　答：如果出現(xiàn)該種情況，我們會綜合考慮多種因素，具體解決方案由雙方協(xié)商解決。

常規(guī)樣本寄送及保存

　　1、基因組DNA：樣品濃度不低于50 ng/ul，總體積不少于20 ul。對于未抽提的基因組DNA，樣本量不低于2g.(如土壤、糞便、動物組織、腸道內(nèi)容物等)
　　2、水樣：2L以上水過濾后的濾膜，若環(huán)境中微生物豐富，可適當(dāng)減少水的體積。
　　3、分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、淚水等）
　　4、非致病性：如果您的菌體帶有致病性，請您提供加熱處理后的基因組DNA。我們不接受有致病性的樣品。
　　5、寄送溫度：推薦干冰低溫運輸。
　　6、請盡量避免樣本送達時間在節(jié)假日，以確保您的樣本能及時送達。
　　7、特殊樣本或珍貴樣本請?zhí)崆奥?lián)系我公司，經(jīng)我公司允許后寄送。

常見問題，首發(fā)于微基生物。

DGGE作為一種成熟的分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、醫(yī)學(xué)（各種疾病治療前后，病變部位微生物的差異）、人體（鼻咽、口腔、黏膜、腸道）等領(lǐng)域進行微生物多樣性分析。

實驗流程圖：

實驗結(jié)果

實驗結(jié)果包括以下內(nèi)容

1 引物設(shè)計

以下是DGGE中常用的引物，我們將根據(jù)客戶的不同需求，進行針對性的引物設(shè)計。

2 基因組DNA抽提電泳檢測圖

針對客戶的樣本來源不同，我們針對性優(yōu)化不同的基因組抽提方法，已達到提取效果最佳。

　　說明：1-8為樣本所抽提基因組DNA，上樣量3uL；M為1kb Marker上數(shù)第一條帶為8 kb，中間的亮帶為3kb，濃度為30ng/uL，其余為10 ng/uL。

3 目的片段PCR檢測

　　說明：1-8為樣本，負(fù)為負(fù)對照（說明我們的實驗沒有污染，這對分子實驗是至關(guān)重要的），上樣量為5uL；M為DL2000 Marker，上樣量3uL。其中亮帶為20ng/uL，其余為10 ng/uL。
Reconditioning PCR：

　　第一輪PCR產(chǎn)物將會作為新的模板再進行少數(shù)循環(huán)的第二輪PCR擴增，這叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的過程中引物和模板之間的比例始終保持在較高的水平上，因此可以保證引物與模板之間的退火要優(yōu)先于不同模板之間的退火，消除異源雙鏈（Heteroduplex）污染對于PCR-DGGE圖譜的觀察和分析。

參考文獻：
　　(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.
　　(2)不同外源擾動因素對腸道菌群組成結(jié)構(gòu)影響的研究. 上海交通大學(xué) 2008 屆博士學(xué)位論文.

4 DGGE圖譜分析

　　4.1 DGGE膠圖和條形圖
?
　　4.2 戴斯相似性系數(shù)

?圖注：lane:代表樣品編號

　　4.3微生物多樣性指數(shù)

4.4 UPGAM法進行樣品間的聚類分析圖

　　常見聚類分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s
　　4.5微生物群落的多維定標(biāo)分析

　　4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）

　　4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）

5 .主要膠條進行割膠

6 割膠條帶的DNA回收、二擴及TA克隆

6.1 二擴電泳檢測
　　分別取5 μL PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如下圖所示

　　電泳檢測結(jié)果顯示：PCR產(chǎn)物條帶單一，片段大小正確，可進行膠回收。
6.2 膠回收
　　采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收 PCR 產(chǎn)物，取3 μL回收產(chǎn)物進行電泳檢測。
6.3 TA連接及轉(zhuǎn)化
　　PCR產(chǎn)物的克隆使用 BioLinker的pED-T載體試劑盒。
6.4 陽性克隆的篩選及測序
　　在平板上隨機挑取8個克隆搖菌，菌液進行M13檢測，挑取3個陽性克隆進行測序。

7 測序結(jié)果匯總

7.1 fasta文件
　　全部測序結(jié)果進行整理，去除載體序列，將其整理為fasta格式的序列文件，為后續(xù)分析做準(zhǔn)備。

7.2克隆子一致性分析（Alignment比對）

一般每個條帶送三個克隆子進行測序，那么三個克隆子所測序列的一致性如何，我們通過clonemanager軟件進行序列性的分析，如果克隆子的測序結(jié)果完全一致，那么會以綠色的覆蓋形式表示，若是序列不一致，會是白色區(qū)域。如下圖所示：

7.3測序結(jié)果NCBI的Blast比對匯總表

7.4測序結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

?DGGE技術(shù)的優(yōu)缺點

優(yōu)點：1. 高效，理論上可以分離開一個堿基差異的DNA片段。
　　　2. 方便，不用對樣品進行標(biāo)記
　　　3. 快速，對于已知DGGE條件的樣品，可在短時間能獲取DGGE圖譜
　　　4. 直觀，DGGE圖譜可直觀的反應(yīng)出樣品中個組分的豐富度
　　　5. 穩(wěn)定，DGGE作為一種成熟的技術(shù)，可重復(fù)性高
　　　6. 可多樣本同時分析，展現(xiàn)各樣本的差異
缺點：1. 僅能檢測樣本中的主要微生物，占總量1%以上的微生物才能被檢測到。
　　　2. DGGE只能對200-700bp的片段有效地分離，過大或者過小的片段分離效果都不是很好。
　　　3. 因為儀器數(shù)值有上限，對于某些某種主要菌株占比較大又要展現(xiàn)大部分條帶的樣品，通過DGGE圖譜不能很好的反映出各個菌株的豐富度。
　　　4. 不同序列的DNA有可能發(fā)生共遷移而導(dǎo)致某些條帶會有多種不同的DNA片段
　　　5. 因為某些物種的基因不同拷貝之間存在異質(zhì)性，即使一個堿基的差別都會使他們分開，而導(dǎo)致不同的條帶是相同物種。
　　　6. DGGE技術(shù)對微生物的分類鑒定依賴于基因數(shù)據(jù)庫,若數(shù)據(jù)庫中基因序列信息不夠豐富,將會限制DGGE的使用。
　　　7. 由于某些種類的16S rDNA不同拷貝之間的多態(tài)性問題,可能導(dǎo)致自然群落中細(xì)菌數(shù)量的過多估計。

送樣要求

1 、環(huán)境樣品基因組DNA

　　1） 請?zhí)峁舛却笥?0ng/uL，總量大于500ng的基因組DNA，DNA純度較差或降解嚴(yán)重會影響后繼的擴增實驗。如果方便的話，可提供電子版DNA電泳檢測照片及OD260/280比值。
　　2） 樣品在保存期間避免反復(fù)凍融。
　　3） 送樣務(wù)必標(biāo)清楚樣品編號，并用parafilm膜對管口進行密封。
　　4）請務(wù)必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。

2、 環(huán)境樣品

　　1）送樣樣品盡量保證新鮮，為了防止微生物死亡或DNA降解，采樣后建議立即冰凍保存，如樣本極為珍貴，建議采用液氮速凍后-80℃冰箱保存。
　　2）樣品在保存期間避免反復(fù)凍融。
　　3）若是樣品中含有大量的腐殖質(zhì)酸、重金屬等PCR反應(yīng)抑制劑，請在送樣時注明。
　　4）請務(wù)必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。
送樣條件：
以上兩種類型的樣本，送樣時采用干冰保存運輸；若是距離較遠(yuǎn)，建議采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

3、各類未抽提基因組樣品的送樣量：

　　土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、農(nóng)田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
　　糞便：3-5 g
　　腸道內(nèi)容物：3-5 g
　　動物組織：3-5g（鰓、胃粘膜、腸粘膜、口腔黏膜等）
　　分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、淚水等）
　　水樣：2L以上水過濾后的濾膜，若環(huán)境中微生物豐富，可適當(dāng)減少水的體積。
　　植物內(nèi)生菌：10-20g葉片；3-5g根系。
　　血液：10mL。
　　葉片：50-100g
　　其他來源的樣品請垂詢：400-660-9270或郵件：support@tinygene.com,我們會在第一時間回復(fù)您！
　　以上用PP材料的epp管或螺口管盛裝即可。

PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳），首發(fā)于微基生物。