微基生物提供土壤微生物多樣性分析的整體科研服務(wù)：實(shí)驗(yàn)規(guī)劃->樣本采集保存->分子實(shí)驗(yàn)->生信統(tǒng)計(jì)分析->論文協(xié)助

　　微基生物采用高通量測(cè)序、PCR-DGGE、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行序列測(cè)定，并通過(guò)生信統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，揭示腸道中微生物的種類以及它們之間的相對(duì)豐度和進(jìn)化關(guān)系，探討微生物多樣性，研究土壤微生物與環(huán)境間的相關(guān)關(guān)系。

技術(shù)路線：

高通量分析流程

PCR-DGGE分析流程

檢測(cè)平臺(tái)：

　　微基生物擁有Illumina MiSeq、Ion PGM、Roche 454高通量測(cè)序分析，PacBio第三代高通量測(cè)序分析，PCR-DGGE變性梯度凝膠分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time qPCR），克隆文庫(kù)等檢測(cè)平臺(tái)。

樣品采集：

　　微基生物為客戶提供樣品采集的配套工具，如采集盒、保存液、取樣勺和保存管等。

送樣要求：

樣品原樣

　　(1)樣品類型：土壤，新鮮取樣，凍存于-80℃

　　(2)樣品需求：≥2g

　　(3)樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)請(qǐng)使用冰袋或干冰運(yùn)輸

DNA類型

　　(1) 樣品類型： DNA

　　(2) 樣品需求量：≥300ng

　　(3) 樣品濃度： ≥10ng/μL

　　(4) 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無(wú)降解

　　(5) 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)請(qǐng)使用冰袋或干冰運(yùn)輸

　　(6) 對(duì)于本種類型的樣品，我們?cè)跈z測(cè)完樣品的質(zhì)量后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增等后續(xù)試驗(yàn)

生物信息與統(tǒng)計(jì)學(xué)服務(wù)：

　　生信分析項(xiàng)目

　　更多微生態(tài)方向研究和生物信息方面服務(wù)，請(qǐng)?jiān)斣儯?em>400-660-9270

案例分析

　　標(biāo)題：由長(zhǎng)期的土壤移植引起的緯度和氣候變化明顯改變了土壤微生物的變化率

　　研究領(lǐng)域：土壤微生物

　　分析物種：細(xì)菌

?取樣方法：從中科院封丘站取1.4*1.2*1.0體積的土壤，分別向北移植到黑龍江海倫站，向南移植到江西鷹潭站。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，于2006-2011年每年的8-9月取20 cm的表層土，密封在聚乙烯包裝袋中，于-80?C保存。

　　高通量測(cè)序平臺(tái)：Illumina MiSeq 2×150

　　測(cè)序區(qū)域：16S rRNA gene V4區(qū)

　　樣本數(shù)及分組：分3組，3個(gè)重復(fù)，共63個(gè)樣本。

　　研究背景：

　　生物群體對(duì)由某些人為因素造成的潛在威脅（如氣候改變）的響應(yīng)是目前生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。鑒于微生物在生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用，它們對(duì)氣候改變的響應(yīng)有可能導(dǎo)致生態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。之前已有研究指出，溫度是影響土壤微生物組成和生態(tài)功能（土壤的呼吸作用、有機(jī)物的含量、固氮水平）的重要因素。而不同地域之間的土壤移植為研究微生物群落對(duì)氣候變化的響應(yīng)提供了新的研究方法和思路。
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　　主要結(jié)果：

（1）微生物的演替

　　隨著時(shí)間的推移，向北、向南移植的土壤中，微生物的群落組成差異越來(lái)越大，微生物多樣性逐漸增加。

（2）由土壤移植引起的土壤微生物的變化

　　微生物隨時(shí)間衰減的斜率可以用來(lái)衡量微生物群落的相似性。本研究中，在各個(gè)樣本的微生物群落中都存在顯著的的時(shí)間衰減關(guān)系。向北、向南移植的土壤中，微生物隨時(shí)間衰減的斜率均比原位土壤的斜率大，尤其是在向南移植的土壤中。

　　隨著溫度的升高/降低，微生物的變化率也相應(yīng)地增加。隨著土壤向南移植，氣候變暖，微生物群落的波動(dòng)性增大，微生物群落的變化增加。向南移植對(duì)土壤微生物群落的變化具有出更好的效果。有趣的是，研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落（門水平）的改變與分類學(xué)的分度有關(guān)。其中變形菌門、擬桿菌門和疣微菌門與門的豐度呈負(fù)相關(guān)，而酸桿菌門、放線菌門、后壁菌門和浮霉菌門與門的豐度呈正相關(guān)。

（3）細(xì)菌群落及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

　　在為期六年的試驗(yàn)中，三個(gè)樣本共檢測(cè)出78個(gè)OTUs，其OTU的數(shù)量非常少，分屬于9個(gè)門。用MEGA 5作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如下圖所示。

　　其中，酸桿菌門中的Gp4和Gp6、節(jié)細(xì)菌屬、硝化螺菌屬、鞘氨醇單胞菌、Fervidicoccus、Sphingosinicella、Steroidobacter和Terrimonas是主要菌群。

（4）微生物演替與環(huán)境因子的關(guān)系

　　微生物的演替與環(huán)境因子之間的關(guān)系用CCA分析如下。結(jié)果表明，向北移植的土壤中，微生物群落的多樣性與土壤的物理化學(xué)因子有關(guān)；而向南移植的土壤中，微生物群落的多樣性受溫度和降水的影響較大。

　　本研究采用illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)經(jīng)過(guò)移植的土壤微生物為研究對(duì)象，擴(kuò)增了細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)域，從而得到土壤中細(xì)菌種群分布的相關(guān)信息，對(duì)其中的微生物種群變化進(jìn)行了調(diào)查研究。
　　此實(shí)驗(yàn)采用illumina MiSeq 2*150雙端測(cè)序，每個(gè)樣品可得到948,765條序列，其中有效序列為10,947條。研究發(fā)現(xiàn)，與原位土壤相比，向北移植（低溫）的土壤中，細(xì)菌的豐度增加，演替速率升高；向南移植（高溫）的土壤中，細(xì)菌的豐度降低，而演替速率達(dá)到最高，即穩(wěn)定性不好。推斷這是由于高溫環(huán)境容易引起高的代謝率和更加激烈的生存競(jìng)爭(zhēng)造成的。

原文鏈接：http://www.nature.com/ismej/journal/vaop/ncurrent/full/ismej201578a.html
參考文獻(xiàn)：
Liang, Y., Y. Jiang, F. Wang, C. Wen, Y. Deng, K. Xue, Y. Qin, Y. Yang, L. Wu, J. Zhou and B. Sun (2015). “Long-term soil transplant simulating climate change with latitude significantly alters microbial temporal turnover.” ISME J.

微基生物進(jìn)行微生態(tài)與環(huán)境相關(guān)的研究與應(yīng)用：

土壤微生物，首發(fā)于微基生物。

　　微基生物采用高通量測(cè)序、PCR-DGGE、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行序列測(cè)定，并通過(guò)生信統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，揭示腸道中微生物的種類以及它們之間的相對(duì)豐度和進(jìn)化關(guān)系，探討微生物多樣性，研究根系微生物與環(huán)境間的相關(guān)關(guān)系。

技術(shù)路線：

高通量分析流程

PCR-DGGE分析流程

檢測(cè)平臺(tái)：

　　微基生物擁有Illumina MiSeq、Ion PGM、Roche 454高通量測(cè)序分析，PacBio第三代高通量測(cè)序分析，PCR-DGGE變性梯度凝膠分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time qPCR），克隆文庫(kù)等檢測(cè)平臺(tái)。

樣品采集：

　　微基生物為客戶提供樣品采集的配套工具，如采集盒、保存液、取樣勺和保存管等。

送樣要求：

樣品原樣

　　(1)樣品類型：根系微生物，新鮮取樣，凍存于-80℃

　　(2)樣品需求：≥2g

　　(3)樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)請(qǐng)使用冰袋或干冰運(yùn)輸

DNA類型

　　(1) 樣品類型： DNA

　　(2) 樣品需求量：≥300ng

　　(3) 樣品濃度： ≥10ng/μL

　　(4) 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無(wú)降解

　　(5) 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)請(qǐng)使用冰袋或干冰運(yùn)輸

　　(6) 對(duì)于本種類型的樣品，我們?cè)跈z測(cè)完樣品的質(zhì)量后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增等后續(xù)試驗(yàn)

生物信息與統(tǒng)計(jì)學(xué)服務(wù)：

　　生信分析項(xiàng)目

　　更多微生態(tài)方向研究和生物信息方面服務(wù)，請(qǐng)?jiān)斣儯?em>400-660-9270

標(biāo)題：運(yùn)用PCR-DGGE和焦磷酸測(cè)序分析（Roche 454）對(duì)紅樹(shù)林濕地和根圍古菌的多樣性分析

研究領(lǐng)域：根系微生物

分析物種：古菌

研究區(qū)域：16S rRNA V4 and V5 regions

研究方法：PCR-DGGE和Roche 454

主要結(jié)果：

1. 實(shí)驗(yàn)DGGE結(jié)果

　　2.兩個(gè)PCO軸和展示了所有數(shù)據(jù)集58%的變種，（根圍上、中、下古菌菌群的展示）

　　3.采用重測(cè)樣對(duì)16S rRNA的樣本寬度和樣本測(cè)序豐富度曲線

4.運(yùn)用RDP的分類器算法統(tǒng)計(jì)出古菌16S rRNA在三個(gè)不同地方的差異

5.根際微生物中不同地方占主導(dǎo)地位OUT的相關(guān)關(guān)系

6.被檢索到的古菌序列的具體分類

原文鏈接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22660713

參考文獻(xiàn)：

Pires, A. C., D. F. Cleary, A. Almeida, A. Cunha, S. Dealtry, L. C. Mendonca-Hagler, K. Smalla and N. C. Gomes (2012). “Denaturing gradient gel electrophoresis and barcoded pyrosequencing reveal unprecedented archaeal diversity in mangrove sediment and rhizosphere samples.” Appl Environ Microbiol 78(16): 5520-5528.

根系微生物，首發(fā)于微基生物。

細(xì)菌或原核生物16S rRNA

真核生物 18S

古菌16S rRNA

真菌ITS

功能微生物

• 數(shù)據(jù)庫(kù)：Silva，GreenGene，RDP

收集目前三大微生物rRNA基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)。

• 高通量測(cè)序

目前市面上常用的用于研究環(huán)境微生物的高通量測(cè)序平臺(tái)有Illumina MiSeq，Roche 454和Ion Torrent PGM。Illumina MiSeq平臺(tái)憑借其測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)、測(cè)序周期短、通量大等特點(diǎn)，成為使用普遍使用的測(cè)序平臺(tái)。 高通量分析流程：

• 樣品采集及運(yùn)送：

新鮮樣品：內(nèi)容物2-3 g
　　DNA樣品：濃度大于 10 ng/uL，總量大于500ng 的基因組 DNA。DNA 純度較差或降解嚴(yán)重會(huì)影響后繼的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。如果方便的話，可提供電子版DNA電泳檢測(cè)照片及 OD260/280
　　樣品運(yùn)送：送樣時(shí)采用干冰保存運(yùn)輸；若是距離較遠(yuǎn)，建議采用干冰加冰袋的方式，與樣品一起存放于冰盒中。 生信/統(tǒng)計(jì)分析 案例分析 標(biāo)題：牛產(chǎn)前和產(chǎn)后瘤胃微生物組的研究：與乳品特性和產(chǎn)量的關(guān)系 研究領(lǐng)域：牛瘤胃微生物組 研究物種： 細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)、真核生物18S rRNA V9區(qū) 高通量測(cè)序平臺(tái)：Illumina MiSeq 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)奶牛初次分娩和多次分娩)產(chǎn)前產(chǎn)后的16S rRNA序列集合的微生物組成的OTU相對(duì)豐度 （2）基于真核生物18S rRNA基因測(cè)序的相對(duì)豐度 （3）奶牛初次分娩和多次分娩產(chǎn)前產(chǎn)后微生物多樣性差異分析 （4）初次生產(chǎn)和多次生產(chǎn)的奶牛細(xì)菌類群在不同時(shí)間內(nèi)瘤胃微生物組的組成 （5）不同時(shí)期初次生產(chǎn)和多次生產(chǎn)的奶牛在產(chǎn)前和產(chǎn)后奶牛產(chǎn)奶量，豐度指數(shù)Chao1（a和b）和Shannon（c和d） （6）初產(chǎn)奶牛產(chǎn)前產(chǎn)后牛奶的厚壁菌門/擬桿菌門顯著高于多次生產(chǎn)的奶牛 （7）細(xì)菌類群之間的相關(guān)性顯著差異，產(chǎn)奶量和產(chǎn)量的周平均值的相關(guān)關(guān)系   （8）用微生物組預(yù)測(cè)產(chǎn)犢前后的牛奶產(chǎn)量和實(shí)際每周產(chǎn)奶平均值呈顯著相關(guān)性  
原文鏈接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25501481 參考文獻(xiàn)：
Lima, F. S., G. Oikonomou, S. F. Lima, M. L. Bicalho, E. K. Ganda, J. C. Filho, G. Lorenzo, P. Trojacanec and R. C. Bicalhoa (2015). “Prepartum and postpartum rumen fluid microbiomes: characterization and correlation with production traits in dairy cows.” Appl Environ Microbiol 81(4): 1327-1337.

瘤胃微生物多樣性分析，首發(fā)于微基生物。

　　微基生物提供消化道微生物多樣性分析的整體科研服務(wù)：實(shí)驗(yàn)規(guī)劃->樣本采集保存->分子實(shí)驗(yàn)->生信統(tǒng)計(jì)分析->論文協(xié)助

　　微基生物采用高通量測(cè)序、PCR-DGGE、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行序列測(cè)定，并通過(guò)生信統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，揭示腸道中微生物的種類以及它們之間的相對(duì)豐度和進(jìn)化關(guān)系，探討微生物多樣性，研究消化道微生物與環(huán)境間的相關(guān)關(guān)系。

技術(shù)路線：

高通量分析流程

PCR-DGGE分析流程

檢測(cè)平臺(tái)：

　　微基生物擁有Illumina MiSeq、Ion PGM、Roche 454高通量測(cè)序分析，PacBio第三代高通量測(cè)序分析，PCR-DGGE變性梯度凝膠分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time qPCR），克隆文庫(kù)等檢測(cè)平臺(tái)。

樣品采集：

　　微基生物為客戶提供樣品采集的配套工具，如采集盒、保存液、取樣勺和保存管等。

送樣要求：

樣品原樣

　　(1)樣品類型：消化道內(nèi)容物，新鮮取樣，凍存于-80℃

　　(2)樣品需求：≥2g

　　(3)樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)請(qǐng)使用冰袋或干冰運(yùn)輸

DNA類型

　　(1) 樣品類型： DNA

　　(2) 樣品需求量：≥300ng

　　(3) 樣品濃度： ≥10ng/μL

　　(4) 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無(wú)降解

　　(5) 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)請(qǐng)使用冰袋或干冰運(yùn)輸

　　(6) 對(duì)于本種類型的樣品，我們?cè)跈z測(cè)完樣品的質(zhì)量后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增等后續(xù)試驗(yàn)

生物信息與統(tǒng)計(jì)學(xué)服務(wù)：

　　生信分析項(xiàng)目

更多微生態(tài)方向研究和生物信息方面服務(wù)，請(qǐng)?jiān)斣儯?em>400-660-9270

消化道微生物，首發(fā)于微基生物。

在自然界的各類環(huán)境中，都有微生物的存在，它們?cè)诟髯缘摹皪徫弧鄙隙及l(fā)揮著或大或小、或多或少的作用。有一些具有特殊功能的微生物，由于其作用的重要性或特殊性而受到人們的廣泛關(guān)注，這些具有特殊功能的微生物叫做功能微生物，如氨氧化細(xì)菌、硫細(xì)菌、硝化細(xì)菌等。它們?cè)诜诸悓W(xué)上有可能差異很大，但卻具有相同或類似的基因使其能夠發(fā)揮同樣的作用。支配這些功能細(xì)菌發(fā)揮重要功能的基因被稱為功能基因，如amoA、dsrB、nxrA。目前微基生物已收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其對(duì)應(yīng)的種屬信息，構(gòu)建自己的功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)。 微基生物進(jìn)行人體健康相關(guān)的研究與應(yīng)用：

功能基因/持家基因分析的流程圖如下：

• 數(shù)據(jù)庫(kù)：Silva，GreenGene，RDP

微基生物收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其對(duì)應(yīng)的種屬信息，構(gòu)建自己的功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

• 高通量測(cè)序

目前市面上常用的用于研究環(huán)境微生物的高通量測(cè)序平臺(tái)有Illumina，BGI，PacBio和Thermo Ion。其中Illumina平臺(tái)的測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)、測(cè)序周期短、通量大，成為常用的測(cè)序平臺(tái)。

微基生物是國(guó)內(nèi)首家采用Illumina MiSeq 2×300 bp平臺(tái)進(jìn)行微生物生態(tài)研究。在功能基因進(jìn)行測(cè)序分析方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

• 建庫(kù)及生信/統(tǒng)計(jì)分析

案例分析

標(biāo)題：Response of denitro bacteria involved in nitrogen removal for treatment of simulated livestock wastewater using a novel bioreactor脫氮細(xì)菌在新型生物反應(yīng)器處理模擬家畜廢水脫氮過(guò)程中的作用

Ecological Engineering（IF: 3.512）

研究領(lǐng)域：功能微生物

高通量測(cè)序平臺(tái)：Illumina MiSeq

測(cè)序區(qū)域：napA, narG, nirS, qnorB, and nosZ

主要結(jié)果：（1）微生物群落組成的演替反映在CFM組和DAS組之間的顯著差異的熱圖上， 主要體現(xiàn)為中華根瘤菌及固氮菌的不同比例。

（2）環(huán)境變量對(duì)反硝化群落的存在影響及優(yōu)勢(shì)屬與氮濃度有一定的相關(guān)性

（3）選出29個(gè)相對(duì)豐度較高的屬(每個(gè)功能基因選出3 ~ 4個(gè)相對(duì)豐度最高的屬)，構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)它們之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，選擇相對(duì)豐度和適應(yīng)性較高的菌株，如目標(biāo)生態(tài)位中的Burkholderia, Azoarcus, 和 Rhodanobacter ，加入到細(xì)菌接種劑可以實(shí)現(xiàn)快速繁殖，并通過(guò)自身的酶活性直接改變理化參數(shù)。此外，根據(jù)系統(tǒng)中的負(fù)相關(guān)關(guān)系，人工增菌可以抑制具有去除化學(xué)需氧量和氮的副作用的細(xì)菌，從而提高裝置的運(yùn)行效果。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0925857420300501

參考文獻(xiàn)：Wang L , Xu W , Yu J , et al. Response of denitrobacteria involved in nitrogen removal for treatment of simulated livestock wastewater using a novel bioreactor[J]. Ecological Engineering, 2020, 147:105762.

特定功能微生物多樣性分析，首發(fā)于微基生物。