水源微生物多樣性分析

基于16S rDNA基因、18S rDNA基因和ITS序列，利用NGS測(cè)序技術(shù)（454 GS FLX,Illimina HiSeq,MiSeq）來分析水源（包括河水、湖水、冰川融水、海水等）微生物（包括原核微生物、真核微生物）的多樣性，解析不同環(huán)境樣本中的微生物多樣性差異，同時(shí)，第二代高通量測(cè)序擁有龐大的數(shù)據(jù)信息，更能進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析出不同的水源環(huán)境中影響微生物群落及多樣性的主要因素。水體中微生物種類繁多，數(shù)量巨大，通過對(duì)水體微生物的種群結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解析并研究其動(dòng)態(tài)變化，即可為充分了解水源微生物組成、優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)群落功能提供可靠的依據(jù)。

高通量測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1.測(cè)序通量高，可檢測(cè)到環(huán)境樣品中的痕量微生物。
2.實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)化，無(wú)需構(gòu)建復(fù)雜的基因文庫(kù)。
3.PCR產(chǎn)物可直接進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)周期短。
4.測(cè)序數(shù)據(jù)便于后期生物信息學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能全面的反應(yīng)環(huán)境中菌落的特點(diǎn)。

研究現(xiàn)狀：

1、S. Bougouffaa等對(duì)紅海裂口處Atlantis II和Discovery兩個(gè)地點(diǎn)縱剖面的微生物群落和影響環(huán)境因子進(jìn)行全面的分析。研究發(fā)現(xiàn)最深的對(duì)流層處細(xì)胞密度低，但是微生物多樣性極高，豐度很低。令人驚奇的是鹽分高的海水處的細(xì)胞數(shù)量顯著高于覆深海水，而他們的微生物多樣性卻是極低的。細(xì)菌和古細(xì)菌隨海水縱剖面主要微生物類群發(fā)生改變。雖然最底層的對(duì)流層海水中，溫度和重金屬離子的濃度都各不相同，但是卻存在著一些有趣的相似的微生物類群。多變量分析顯示，溫度和鹽度是影響微生物群落的主要因素。
Distinctive Microbial Community Structure in Highly Stratified Deep-Sea Brine Water Columns
S. Bougouffaa, J. K. Yanga, O. O. Leea, Y. Wanga, Z. Batangb, A. Al-Suwailemb and P. Y. Qiana
Applied and Environmental Microbiology，June 2013 Volume 79 Number 11
水樣收集：10L規(guī)定地點(diǎn)處的水樣取出后立即過1.6um孔徑的玻璃纖維過濾器，除去懸浮物和真核微生物。而后過0.22um孔徑的聚碳酸酯膜收集微生物細(xì)胞。
樣本的保存：聚碳酸酯膜保存在含有0.8mL的管中，凍存于-80℃，而后置于干冰中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備基因組DNA抽提。
環(huán)境參數(shù)測(cè)量：溫度、鹽度、營(yíng)養(yǎng)濃度（NO3-, PO43-，Si, SO42-）、金屬離子濃度（Cu，F(xiàn)e、Mn）采用CTD裝置和HACH DR/890便攜式比色計(jì)；總有機(jī)碳、總無(wú)機(jī)氮測(cè)定采用TOC分析器；NH4+和NO2-在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定。
基因組DNA抽提方法：基于SDS的抽提方法
測(cè)序平臺(tái)：454 FLX Titanium platform
主要結(jié)論：
（1）焦磷酸測(cè)序讀長(zhǎng)的分類學(xué)統(tǒng)計(jì)
（a）所以讀長(zhǎng)在門水平上的分類統(tǒng)計(jì)（b）細(xì)菌讀長(zhǎng)在綱水平上的統(tǒng)計(jì)（c）古細(xì)菌讀長(zhǎng)在綱水平上的統(tǒng)計(jì)

 

（2）樣本間的UPGMA（非加權(quán)平均法）樹，顯示各樣本間微生物群落的聚類關(guān)系

 

（3）PCoA分析各地點(diǎn)各深度樣本間微生物群落的相似性

（4）RDA分析環(huán)境因子與細(xì)菌和古細(xì)菌之間的關(guān)系