實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）

原理
　　在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累計實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
特點(diǎn)
　　檢測儀器少，只用一臺儀器。
　　檢測時間短，只須45分鐘～1小時10分鐘（試劑各異），而定性PCR須3～4小時，酶免終點(diǎn)定量須6～8小時，熒光終點(diǎn)定量須2～3小時。
　　操作極其簡單：前處理后，樣本插入儀器一小時后到電腦上來出報告即可，無須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。
　　結(jié)果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點(diǎn)定量PCR由于只能在40個熱循環(huán)結(jié)束后檢測熒光，被測熒光達(dá)到飽和導(dǎo)致定量不夠精確，屬于半定量狀態(tài)。而實(shí)時熒光QPCR是在擴(kuò)增的每時每刻連續(xù)檢測各樣本的熒光值的變化。
應(yīng)用
　　基因擴(kuò)增、檢測、定量分析； 擴(kuò)增特異性分析；SNP分析；RFLP多態(tài)性分析；單/多基因表達(dá)研究；高通量基因表達(dá)譜研究。

微基生物其QPCR定量實(shí)驗(yàn)流程：
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
　　標(biāo)準(zhǔn)曲線利用含有qPCR目的片段的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)基因，具體步驟如下：
　　（1） 選用克隆文庫中含有目標(biāo)基因質(zhì)粒的搖瓶培養(yǎng)；

根據(jù)客戶需求，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（16S/18S/ITS/功能基因）

　　（2）試劑盒提取質(zhì)粒；
　?。?）測定質(zhì)粒濃度；
　?。?）對質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行計算；
　　（5）將質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品一起擴(kuò)增，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
　?。?）根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以基因拷貝數(shù)每μL為單位進(jìn)行分析。
2、熒光定量
　　（1）本研究通過熒光定量的方法細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行定量。引物選取->qPCR。

根據(jù)客戶需求設(shè)計的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

　?。?）PCR擴(kuò)增程序1
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
4、樣品中拷貝數(shù)測定