腫瘤石蠟切片（FFPE）樣本5R 16S高通量測序 ——實現(xiàn)腫瘤中微生物多樣性檢測

                

微生物與腫瘤細(xì)胞的相互作用Unexpected guests in the tumor microenvironment: microbiome in cancer

 

服務(wù)簡介  具有復(fù)雜功能的微生物被發(fā)現(xiàn)是腫瘤微環(huán)境中的一個潛在成分。由于其生物量低和其他障礙,對內(nèi)部微生物群的了解很少。微基生物對于腫瘤微生物的檢測采用5R 16S測序的方法，大幅提高了細(xì)菌物種檢測的覆蓋率和分辨率。

5R 16S測序原理

 

5R 16S擴增16S rRNA基因的5個區(qū)域                  灰色R1-R5表示5R 16S擴增的5個區(qū)域

The human tumor microbiome is composed of tumor type–specific intracellular bacteria

對于腫瘤樣本微生物的檢測采用5R 16S測序，即對16S rRNA基因上的五個區(qū)域（V2、V3、V5、V6、V8）進(jìn)行多重PCR擴增和測序。這種方法能兼容有一定程度降解的FFPE樣本，并增加分析的分辨率。與V3 V4區(qū)擴增策略相比，擴增出的區(qū)域覆蓋約68%的16S全長序列，可以大幅提高細(xì)菌物種檢測的覆蓋率和分辨率，尤其適合于低生物量的微生物樣本檢測。

腫瘤微生物組（Tumor Microbiome）或稱瘤內(nèi)微生物組（Intratumoral Microbiome）是腫瘤微環(huán)境中不可或缺的成員，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展乃至治療緊密相關(guān)。通過比較腫瘤內(nèi)微生物群與體內(nèi)其他部位的微生物群組成可能有助于我們識別存在于不同腫瘤中的關(guān)鍵微生物，為癌癥預(yù)防提供新的見解。

目前16S rRNA基因擴增子測序和宏基因組學(xué)是鑒定腫瘤內(nèi)微生物群最常用的方法。但由于腫瘤微生物生物量很低，腫瘤樣本呈現(xiàn)出很高的宿主與細(xì)菌DNA比率，導(dǎo)致基于擴增子策略的16S rRNA基因測序，受宿主DNA干擾，引起菌群序列PCR擴增效率降低，甚至擴增失敗。腫瘤微生物的全基因組測序則需要很好的微生物富集策略，否則可能無法進(jìn)行。

基于以上情況，對于腫瘤樣本微生物的檢測采用5R 16S測序。

檢測樣本類型

腫瘤組織、FFPE等低載量生物樣本

切片厚度20μm，10 張。

如果組織塊（切片的一面）暴露在空氣中時間比較久了，表面的DNA會容易降解，頭三張片子不要。
如果病理組織很小塊，片子量20張為宜。

相關(guān)文獻(xiàn)研究

一、人類腫瘤微生物的分布    5R 16S rDNA測序方法

 

引言：細(xì)菌是人類腫瘤中眾所周知的居民，但它們的存在是否對腫瘤有利或?qū)?xì)菌本身有利一直不清楚。研究人員對腫瘤微生物組進(jìn)行了全面分析，研究了七種癌癥類型的1526個腫瘤及其鄰近的正常組織，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、骨癌和腦癌。

我們發(fā)現(xiàn)每種腫瘤類型都有不同的微生物組組成，而乳腺癌具有特別豐富多樣的微生物組。瘤內(nèi)細(xì)菌主要存在于細(xì)胞內(nèi)，存在于癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中。我們還注意到腫瘤內(nèi)細(xì)菌或其預(yù)測功能與腫瘤類型和亞型、患者的吸煙狀況以及對免疫療法的反應(yīng)之間的相關(guān)性。

結(jié)果展示：1.細(xì)菌DNA、RNA和脂多糖存在于許多人類實體腫瘤中

研究7種實體腫瘤,它們代表了常見的癌癥類型,而這些癌癥的微生物群在很大程度上是未知的,如黑色素瘤、骨腫瘤和腦腫瘤。為了解決實驗室攜帶的污染物,我們引入了643個與樣本一起處理的陰性對照,其中包括437個DNA提取對照和206個PCR反應(yīng)無模板對照。為解決樣本到達(dá)實驗室前可能發(fā)生的污染,我們還納入了從研究中使用的石蠟塊(無組織)邊緣采集的168個純石蠟樣品。

我們分析了1010個腫瘤樣本和516個正常樣本,包括來自同一患病的正常鄰近組織(NAT)。

發(fā)現(xiàn),不同的癌癥類型在對細(xì)菌DNA陽性的腫瘤比例上有所不同,從僅14.3%的黑色素瘤到60%的乳腺癌、胰腺癌和骨腫瘤。在與外部環(huán)境沒有直接聯(lián)系的實體腫瘤中也檢測到了細(xì)菌DNA,

例如卵巢癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）和骨癌。

 

A研究中分析的人體樣本數(shù)  B通過細(xì)菌16S rDNA qPCR評估人類腫瘤中細(xì)菌DNA的存在。

2. 瘤內(nèi)細(xì)菌主要存在于細(xì)胞內(nèi)，存在于癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中

病理檢查發(fā)現(xiàn)LPS和細(xì)菌16S rRNA主要分布于癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞(圖A）。在癌細(xì)胞中,細(xì)菌16S rRNA主要在細(xì)胞質(zhì)中檢測到,而LPS染色與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核有關(guān)( 圖B）。CD45陽性白細(xì)胞通過16SrRNA染色表現(xiàn)出比癌細(xì)胞更強的胞質(zhì)細(xì)菌染色(圖C)。LTA陽性細(xì)菌幾乎全部存在于巨噬細(xì)胞中,通過免疫熒光在CD68中進(jìn)行驗證(圖D)。LTA很少在癌細(xì)胞或CD45+/CD68?免疫細(xì)胞中檢測到。雖然在CD45+/CD68+細(xì)胞中，細(xì)菌LPS和LTA染色強度非常強，但FISH在巨噬細(xì)胞中很少發(fā)現(xiàn)細(xì)菌16SrRNA(圖A、D)。這種差異可能反映了巨噬細(xì)胞攝取了細(xì)菌成分，而不是活的細(xì)菌，也可能是由于在細(xì)菌被巨噬細(xì)胞吞噬和處理很長時間后，LPS和LTA在巨噬細(xì)胞中積累所致。此前已有研究表明，巨噬細(xì)胞對細(xì)菌脂多糖的處理非常緩慢；因此，在細(xì)菌被攝入和處理幾個月后，可以在這些細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LPS。

為了進(jìn)一步驗證癌細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存在，我們對4例細(xì)菌LPS和16S rRNA陽性的人類乳腺腫瘤進(jìn)行了相關(guān)光鏡和電子顯微鏡（CLEM）.結(jié)合LPS熒光染色和透射電鏡（TEM）成像，清楚地顯示了所有四種腫瘤中細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)定位(圖E)。

 

腫瘤內(nèi)細(xì)菌存在于癌癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞中。

(A)在459、427和354個腫瘤核心中不同細(xì)胞類型中LPS、LTA和細(xì)菌16S rRNA的染色模式總結(jié)。CD45+/CD68+細(xì)胞被稱為巨噬細(xì)胞；CD45+/CD68?細(xì)胞被稱為其他免疫細(xì)胞。(B)細(xì)菌性LPS和16S rRNA在乳腺癌細(xì)胞中出現(xiàn)。(C)細(xì)菌性LPS和16S rRNA在一個高度炎癥的乳腺腫瘤的CD45+/CD68?細(xì)胞中被證實。(D) A型黑色素瘤腫瘤顯示典型的巨噬細(xì)胞相關(guān)菌(M)染色，LPS和LTA染色陽性，但無16S rRNA染色。附近的腫瘤細(xì)胞(T)顯示典型的LPS和16S rRNA染色，LTA染色陰性。每個插圖都顯示了整個核心的低放大倍數(shù)。高倍率圖像中的比例尺，20毫米。(E) CLEM顯示了人類乳腺癌中的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。IF圖像顯示藍(lán)色為DAPI，紅色為LPS。兩種細(xì)菌用箭頭標(biāo)記。

 

3.乳腺腫瘤的微生物組比其他腫瘤類型更豐富、更多樣化

為了表征腫瘤內(nèi)微生物組，我們開發(fā)了一種多重16S rDNA測序方案，可擴增16S rRNA基因上的五個短區(qū)域：5R 16S rDNA測序方法。通過使用短擴增子擴增68%的細(xì)菌16S rRNA基因，與廣泛使用的V4或V3-V4擴增相比，該方法提高了細(xì)菌物種檢測的覆蓋度和分辨率。此外，它還可應(yīng)用于源自福爾馬林固定石蠟包埋腫瘤的部分降解DNA。

多重16S rDNA測序方案，在不同的腫瘤或正常組織中檢測到9190種細(xì)菌。與其他所有待測腫瘤類型相比，乳腺腫瘤富含微生物組的多樣性更高，在任何單個乳腺腫瘤樣本中平均檢測到16.4種細(xì)菌，而在所有其他腫瘤類型中平均<9種。另外，乳腺腫瘤樣本中的細(xì)菌負(fù)荷和豐富度高于健康受試者正常乳腺樣本中的細(xì)菌負(fù)荷和豐富度。

同時利用5名乳腺癌患者手術(shù)所得到的活體腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤中有來自三個主要門（變形菌門、厚壁菌門、放線菌門）的活細(xì)菌蛋白質(zhì)，驗證了人類腫瘤中存在活細(xì)菌。

  

（A）細(xì)菌16SrRNA基因及其保守（藍(lán)色）和可變（黃色）區(qū)域的圖示。以大腸桿菌K-12亞株MG1655的序列為參考序列。多重5R PCR方法的5個擴增子用灰色表示。(B)應(yīng)用于16S rDNA測序數(shù)據(jù)的分析管道的示意圖。(C)稀疏圖顯示了每個選擇的腫瘤樣本數(shù)量中不同腫瘤類型中通過所有過濾器的細(xì)菌屬的數(shù)量。所有樣本香農(nóng)多樣性指數(shù)的(D) Box blot，按腫瘤類型分開。(E)每個腫瘤中存在細(xì)菌種類數(shù)量的Box blot檢測。(F)在乳腺腫瘤、乳腺NAT和乳腺正常樣本中通過所有過濾器的細(xì)菌屬數(shù)量的稀疏性圖。(G)用熒光標(biāo)記的d-丙氨酸在體外培養(yǎng)2小時的四種人乳腺腫瘤的熒光圖像（藍(lán)色）。

4.不同的腫瘤類型具有不同的微生物組成

使用單一測序方法和平臺來表征多種腫瘤類型中的微生物組，使我們能夠直接比較這些腫瘤的微生物組。比較某一特定腫瘤類型內(nèi)和不同腫瘤類型內(nèi)所有樣本對之間的β多樣性，發(fā)現(xiàn)同一類型腫瘤的微生物組往往比其他腫瘤類型的微生物組更相似。同時，腫瘤類型獨特的微生物組組成在物種水平上也很明顯。

 

（A）Jaccard相似性指數(shù)是根據(jù)所有可能的樣本對之間通過腫瘤(n=528)中所有過濾器的細(xì)菌種類概況計算的。熱圖顯示了來自任何兩種癌癥類型的樣本對之間所有指數(shù)的平均值。（B）不同腫瘤類型的有序級系統(tǒng)發(fā)育型分布。（C）137種細(xì)菌流行率的無監(jiān)督層次聚類，這些細(xì)菌在一種腫瘤類型中被擊中，并且在至少一種腫瘤類型中存在于10%或更多的樣本中。（D）來自(C)的19種細(xì)菌的流行，顯示在不同的腫瘤類型中。（E）不同乳腺腫瘤亞型之間流行率存在顯著差異的細(xì)菌類群顯示在條形圖中。（F）主坐標(biāo)分析(PCoA)雙標(biāo)圖在不同組織類型的細(xì)菌物種譜之間的Jaccard相似性指數(shù)。（G）火山圖顯示了乳房、肺和卵巢樣本中腫瘤(T)及其NAT之間細(xì)菌的差異流行。

 

在本研究中，我們對來自7種人類腫瘤類型的1526個樣本的微生物組進(jìn)行了特征分析。采取了多種措施來最小化和控制污染，并使用5R多重細(xì)菌16S rDNA PCR測序技術(shù)來獲得物種水平的分辨率。通過使用單一平臺探索多種腫瘤類型，可以比較不同的腫瘤類型，并發(fā)現(xiàn)癌癥類型特異性的微生物特征。

 

二、腫瘤中微生物的認(rèn)識

  

隨著對宿主-微生物相互作用的深入研究，腫瘤組織中存在的瘤內(nèi)微生物群的概念被提出。腫瘤內(nèi)微生物在19世紀(jì)首次被觀察到并被描述，但在接下來的一個世紀(jì)中該領(lǐng)域幾乎沒有取得任何進(jìn)展。近年來，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和對腫瘤微環(huán)境（TMEs）的深入了解，越來越多的證據(jù)證實了腫瘤內(nèi)細(xì)菌的存在。

瘤內(nèi)微生物群的來源

 

腫瘤內(nèi)微生物群的來源：A) 粘膜器官。腸道微生物會擾亂粘膜屏障并進(jìn)入腫瘤部位，而胰腺癌的瘤內(nèi)細(xì)菌則通過胰管進(jìn)入腫瘤部位。B) NAT是腫瘤內(nèi)微生物群的潛在來源。C) 循環(huán)系統(tǒng)。腫瘤內(nèi)微生物通過血行傳播從口腔、腸道、腫瘤和其他部位進(jìn)入腫瘤部位。

腫瘤內(nèi)微生物群影響腫瘤發(fā)生和治療的機制

 

誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的兩個主要機制包括引起DNA損傷和激活致癌途徑。腫瘤內(nèi)微生物群也影響抗腫瘤免疫并發(fā)揮復(fù)雜的作用。此外，腫瘤內(nèi)微生物群代謝化療藥物并導(dǎo)致化療耐藥。

不同腫瘤的瘤內(nèi)微生物群的異質(zhì)性

TME具有高度異質(zhì)性，在不同的癌癥中，瘤內(nèi)微生物的組成和豐度也存在顯著差異。因此，腫瘤內(nèi)微生物群對不同癌癥的影響也可能不同。

 

不同腫瘤中腫瘤內(nèi)微生物群的異質(zhì)性 A) 肺腫瘤。有幾種細(xì)菌會影響肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。這些細(xì)菌通過不同的途徑發(fā)揮作用。

B）胃腸道腫瘤。胃腸道腫瘤中微生物群的組成和功能很復(fù)雜。厚壁菌門、硒單胞菌門等多種細(xì)菌與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。

研究腫瘤內(nèi)微生物群的方法

 

腫瘤內(nèi)微生物群和抗腫瘤治療

 

腫瘤內(nèi)微生物群是TME的重要且異質(zhì)的組成部分，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。該領(lǐng)域還有很多問題有待解決，需要技術(shù)的發(fā)展和努力。值得注意的是，腫瘤內(nèi)微生物群的研究具有強大的臨床轉(zhuǎn)化潛力，可能成為抗腫瘤治療的下一個熱點。

三、低微生物生物量微生物組研究中的污染：問題和建議

 

本研究首先回顧了污染物DNA和交叉污染是如何在微生物組研究中產(chǎn)生的，并討論了它們的負(fù)面影響，特別是在低微生物生物量樣本的分析期間。然后，確定了研究人員可以采取的幾個關(guān)鍵措施，以減少污染DNA和交叉污染的影響。

DNA污染影響微生物組研究

 

 

 低微生物生物量樣品的兩個處理組（三角形和圓形）在微生物組成上沒有差異（樣品DNA顏色相同，藍(lán)色和橙色）。然而，由于處理組處理背景不同的，污染物DNA的類型和豐度的差異（紅色和黑色）驅(qū)動了信號，從而導(dǎo)致處理組有不同的微生物組成。

減少DNA污染采取的措施

在低微生物生物量中，減少實驗偏差和引入污染物DNA的措施。

腫瘤微生物組的生物量相對較低，宿主DNA和環(huán)境微生物DNA的污染是最大的障礙。

微基生物對于腫瘤微生物等低微生物樣本的檢測采用5R 16S測序的方法，大幅提高了細(xì)菌物種檢測的覆蓋率和分辨率。歡迎前來咨詢了解：021-50763698。