特定微生物菌株及菌群的qPCR定量檢測中首選探針法

實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是基于PCR的革命性方法。依賴于目標(biāo)序列的高度特異性和高效擴增，以及熒光報告分子的加入，從而能夠?qū)崟r定量PCR產(chǎn)物。

特定微生物菌株及菌群的qPCR定量檢測，對目標(biāo)序列高效且特異性的擴增要求更高。探針法qPCR要達(dá)到檢測的目的，不僅要上下游引物要跟模板匹配，還需要探針與模板匹配，提升了檢測的特異性。對于模板同源性比較高的不同目的基因的檢測和鑒定，在擴增引物特異性沒法保證的情況下，可通過設(shè)計探針的特異性來達(dá)到特異性檢測的目的。微基生物推薦使用具有目標(biāo)特異性的熒光探針TaqMan方法。

以下是qPCR定量分析檢測中常用的兩個方法，嵌合熒光染料法SYBR Green和熒光探針法TaqMan簡單解讀：

嵌合熒光染料和基于水解的熒光探針檢測的原理比較

 

文獻(xiàn)：A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR

A.SYBR®Green 檢測：cDNA變性后，引物退火并延伸。在延伸過程中，SYBR Green與雙鏈DNA(dsDNA) 結(jié)合，發(fā)出熒光信號，可被qPCR儀器檢測到。

B.TaqMan®探針檢測：TaqMan 探針將引物下游與單鏈cDNA結(jié)合。在延伸過程中，聚合酶會分解探針，由于失去與淬滅劑部分的接近度，從而可以檢測到熒光信號。

引物可以在擴增反應(yīng)中與DNA結(jié)合染料結(jié)合使用，以監(jiān)測雙鏈DNA(dsDNA)的出現(xiàn)。熒光標(biāo)記的探針可用于在qPCR測定中獲得更高的特異性。

示例解讀：鵝源星狀病毒TaqMan探針和SYBR Green I染料法熒光定量PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用比較（2022）

探針法和染料法熒光定量PCR的比較

以倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板，對本試驗建立并優(yōu)化的2種熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性的驗證及比較。

 

特異性試驗

結(jié)果顯示：2種熒光定量PCR方法均僅對GoAstV有特異性擴增，其他病原及陰性對照均無特異性擴增，特異性良好。

 

敏感性試驗

結(jié)果顯示：本試驗建立的TaqMan和SYBR Green I熒光定量PCR方法分別比普通RT－PCR方法的靈敏度高100倍和10倍；TaqMan法比SYBR Green I染料法靈敏度高10倍，說明TaqMan探針法熒光定量PCR方法的靈敏性更高。

 

重復(fù)性實驗

結(jié)果顯示：TaqMan熒光定量PCR方法的組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于 SYBR Green I熒光定量PCR的組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)，說明TaqMan熒光定量PCR方法重復(fù)性更好，更加穩(wěn)定。

 

臨床樣品檢測

臨床上71份樣品進(jìn)行檢測，TaqMan熒光定量PCR方法檢測出陽性35例，檢出率為49.3%；SYBR Green I熒光定量PCR方法檢測出陽性30例，檢出率為42.25%；普通RT－PCR方法檢測出陽性21例，檢出率為29.58%。結(jié)果顯示TaqMan熒光定量PCR方法的檢出率最高，與敏感性試驗結(jié)果相一致。

 

對于特定微生物菌株及菌群的qPCR定量檢測微基生物推薦使用探針法，如您有實驗需求，歡迎聯(lián)系我們: 400-660-9270，我們將竭誠幫助您達(dá)成實驗?zāi)繕?biāo)。