微基生物 您自己的微生態(tài)研究團(tuán)隊(duì)|專注微生態(tài)研究與應(yīng)用
實(shí)驗(yàn)流程和目的
步驟一、原始樣本微生態(tài)檢測：
在進(jìn)行分離培養(yǎng)前，需要確認(rèn)待分離的樣本中是否有目標(biāo)菌株，這時(shí)我們需要通過高通量測序的方法來檢測樣本中微生物的種類和相對(duì)豐度。
如果老師希望分離細(xì)菌，那么可以選擇16S V3-V4，或是16S V4-V5區(qū)域?qū)υ紭颖具M(jìn)行測序。如果老師希望分析真菌，那么可以選擇ITS序列進(jìn)行測序。
步驟二、確認(rèn)目標(biāo)菌株
高通量檢測原始樣本中微生物的種類和相對(duì)豐度，確定后續(xù)要進(jìn)行分離純化的目標(biāo)菌株。若樣本中可以檢測到目標(biāo)菌株，則該樣本可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。若原始樣本中沒有目標(biāo)菌株，則建議更換樣本。
如果測序結(jié)果中沒有老師需要的菌株，但是老師有指定菌株的16S序列，我們也可以分析測序結(jié)果中有沒有和老師目標(biāo)16S序列一致的OTU（或是ASV）的代表序列，這樣分析，主要是高通量測序結(jié)果中有些微生物沒有鑒定到具體的種，這時(shí)我們可以根據(jù)16S的序列來判斷目標(biāo)菌株在原始樣本中的相對(duì)豐度。
步驟三、培養(yǎng)條件篩選：
根據(jù)目標(biāo)菌株查找相關(guān)的培養(yǎng)基信息（這個(gè)步驟盡量多采用幾種培養(yǎng)基），將不同的培養(yǎng)基分別配置成固體平板，將樣本進(jìn)行梯度稀釋（如下圖1所示）。
圖1 梯度稀釋的方法
取部分菌液涂布到不同的培養(yǎng)基，按照指定的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，稀釋倍數(shù)低的樣本會(huì)在平板上長成菌苔，而稀釋倍數(shù)高的樣本則會(huì)形成單菌落。例如下圖2所示，從左至右樣本的稀釋倍數(shù)分別為10倍（菌苔）、100倍（菌落）和1000倍（菌落）。
圖2 梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)后的菌苔和菌落
每種培養(yǎng)基挑選一個(gè)菌苔的平板和一個(gè)菌落的平板（如上圖的第1板和第2板），收集的菌體取部分進(jìn)行16S/ITS高通量測序，剩余菌體加保護(hù)劑凍存。生信分析培養(yǎng)出來的微生物種類和相對(duì)豐度，看在哪種培養(yǎng)基上能夠明顯富集目標(biāo)微生物。
若在一種培養(yǎng)基的菌苔和菌落中目標(biāo)菌株的相對(duì)豐度都很低，則表明該菌株不適合用此種方法培養(yǎng)，需要更換其他的培養(yǎng)條件。若目標(biāo)菌株在菌落平板上有培養(yǎng)出來，且相對(duì)豐度較高，則表明該菌株比較容易在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來，可以用這種培養(yǎng)方法做后續(xù)的分離和純化。若目標(biāo)菌株在菌苔樣品中的相對(duì)豐度較高，而在菌落樣品中的相對(duì)豐度較低，則表明此菌株可能和其他菌株之間存在共生關(guān)系，此時(shí)需要考慮使用共培養(yǎng)的方法或使用共生菌的替代物對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分離純化。
步驟四、目標(biāo)菌株分離：
根據(jù)菌苔和菌落的16S高通量結(jié)果，選擇最適合目標(biāo)菌株的培養(yǎng)方法，按照步驟三的方法，將原始樣本稀釋后進(jìn)行涂板培養(yǎng)，挑選平板上的單克隆于96孔板中進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。取擴(kuò)培后部分進(jìn)行進(jìn)行菌種保存，剩余的菌進(jìn)行16S/ITS高通量測序，根據(jù)測序結(jié)果初步篩選出目標(biāo)菌株。
步驟五、目標(biāo)菌株純化：
初篩得到的菌株中可能還存在雜菌，因此需要對(duì)菌株進(jìn)一步純化。取少量菌體在培養(yǎng)基平板上作四區(qū)劃線純化（如圖3所示），根據(jù)目標(biāo)菌株的純度，純化2-3代，并進(jìn)行一代或是二代測序驗(yàn)證，最終獲得純菌株。
圖3 四區(qū)劃線
備注：
有限梯度稀釋培養(yǎng)：對(duì)于不適合在固體培養(yǎng)基平板上生長的菌株，可以采用有限梯度稀釋法進(jìn)行分離純化。
名詞注釋：
1、厭氧培養(yǎng)、需氧培養(yǎng)：
厭氧培養(yǎng)(anaerobic culture)指把微生物置于與分子態(tài)氧隔絕狀態(tài)下（一般是在厭氧手套箱中）進(jìn)行的培養(yǎng)，適用于兼性厭氧菌和專性厭氧菌。
需氧培養(yǎng)（aerobic culture）與厭氧培養(yǎng)相對(duì)的，微生物直接再空氣條件下踐行培養(yǎng)。
2、厭氧手套箱：
厭氧手套箱(Anaerobie glove box)是迄今為止國際上公認(rèn)的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。它是一個(gè)密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個(gè)有機(jī)玻璃做的透明面板，板上裝有兩個(gè)手套，可通過手套在箱內(nèi)進(jìn)行操作。
3、梯度稀釋和取樣涂板：
梯度稀釋就是依次稀釋樣本，比如取1mL原液加入9mL稀釋液中稀釋10倍，混勻后，再從這里面取1mL與9mL稀釋液混和,依次類推,稱梯度稀釋。
4、菌落（colony）/單克隆（clone）：
指由單個(gè)細(xì)胞在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成以母細(xì)胞為中心的一團(tuán)肉眼可見的、有一定形態(tài)和構(gòu)造等特征的子細(xì)胞集團(tuán)。每一種細(xì)菌在一定條件下形成的菌落特征是固定的，而不同種或同種在不同的培養(yǎng)條件下形成的菌落特征是不同的。這些特征對(duì)菌種識(shí)別和鑒定有一定意義。
5、菌苔（lawn）：
與菌落的概念不同，如果是許多細(xì)菌菌體接種在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后長成密集的、不規(guī)則的片狀的細(xì)胞群體，則稱為菌苔。
6、平板劃線純化：
平板劃線法是指把混雜在一起的微生物或同一種微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在培養(yǎng)基平板表明通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純菌種。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來，因此必須反復(fù)分離多次才可得到純菌株。
7、稀釋涂布平板法和平板劃線法的區(qū)別
稀釋涂布平板法一般多用于篩選菌株，而平板劃線法一般多用于純化菌株。二者目的不完全相同。
8、細(xì)菌16S rRNA：
細(xì)菌核糖體RNA（rRNA）有三種類型：5S rRNA（120bp）、16S rRNA（約1540bp）和23S rRNA（約2900bp）。5S rRNA基因序列較短，包含的遺傳信息較少，不適于細(xì)菌種類的分析鑒定；23S rRNA基因的序列太長，且其堿基的突變率較高，不適于鑒定親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)菌種類；16S rRNA普遍存在于原核細(xì)胞中，且含量較高、拷貝數(shù)較多（占細(xì)菌RNA總量的80%以上），便于獲取模板，功能同源性高，遺傳信息量適中，適于作為細(xì)菌多樣性分析的標(biāo)準(zhǔn)。16S rRNA編碼基因序列共有9個(gè)保守區(qū)和9個(gè)高可變區(qū)。其中，文獻(xiàn)中常用的區(qū)域是V1-V2，V3-V4，V4-V5等區(qū)域。
9、真菌ITS：
ITS序列是內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之間，分別為ITS 1和ITS 2。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有較高的保守性，而ITS由于承受較小的自然選擇壓力，在進(jìn)化過程中能夠容忍更多的變異，在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性。同時(shí)，ITS的保守型表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異較明顯，能夠反映出種屬間，甚至菌株間的差異。ITS序列片段較小（ITS 1和ITS 2長度分別為350bp和400bp），易于分析，目前已被廣泛用于真菌不同種屬的系統(tǒng)發(fā)育分析。
10、一代測序：
即Sanger測序，主要特點(diǎn)是測序讀長可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高，但是其通量低，只能對(duì)純菌樣品進(jìn)行測序，無法對(duì)混合樣品進(jìn)行測序。
11、高通量測序：
又稱二代測序技術(shù)，將DNA片段加上接頭后，制備測序文庫，通過對(duì)文庫中數(shù)以萬計(jì)的DNA片段進(jìn)行延伸反應(yīng)，檢測對(duì)應(yīng)的信號(hào)，最終獲取序列信息。與Sanger法為代表的傳統(tǒng)一代測序法相比，高通量測序技術(shù)在處理大規(guī)模樣品時(shí)具有顯著的優(yōu)勢，又快又多，成為目前組學(xué)研究的主要技術(shù)。
12、物種豐度：
指群落內(nèi)物種數(shù)目的多少。物種豐度可分為絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度。絕對(duì)豐度可以用于描述單個(gè)物種的絕對(duì)含量，表征其在不同或相同的環(huán)境群落里數(shù)量的增減；相對(duì)豐度主要用于描述單個(gè)物種占整個(gè)環(huán)境群落的百分比，用于描述單個(gè)物種的優(yōu)勢程度。相對(duì)豐度可以通過單個(gè)物種的絕對(duì)豐度除以整個(gè)群體總量來換算成單個(gè)物種的相對(duì)豐度。
上述流程中指的高通量測序得到的相對(duì)豐度的計(jì)算公式為：
目標(biāo)菌株的相對(duì)豐度=目標(biāo)菌株的sequence數(shù)/該樣本中總的sequence數(shù)*100%。
13、菌落PCR：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的DNA復(fù)制，其最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。菌落PCR是以少量經(jīng)過裂解處理的菌體作為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。
14、共培養(yǎng)：
有些菌株需要依賴其他菌株分泌的代謝物才能生長，在沒有其他菌株輔助的情況下則很難甚至不會(huì)生長，這類菌株被稱為共生菌。若想要分離并純化此類菌株，需要在培養(yǎng)基中加入與其共生的菌株作為輔助培養(yǎng)物。如下圖4所示，黑色字體標(biāo)出的黃色菌落為目標(biāo)菌，白色箭頭指出的即為與目標(biāo)菌株共生的輔助菌株。
圖4 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
15、拿到純菌后可以做什么？
當(dāng)拿到分離純化好的菌株后，可以對(duì)菌株進(jìn)行基因組草圖、完成圖的實(shí)驗(yàn)，還可以進(jìn)行菌株代謝物的檢測，包括胞內(nèi)、胞外代謝物，還可以進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，總之可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)。
16、菌株擴(kuò)培：
分離純化出來的菌株一般只有少量的菌種，如果進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)，那么需要對(duì)菌株進(jìn)行放大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量和質(zhì)量的菌株進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的一般是搖瓶培養(yǎng)，如果需要更大規(guī)模的培養(yǎng)，一般采用發(fā)酵罐。
