腸道菌群多樣性分析 intestinal microbial diversity

腸道菌群多樣性分析 intestinal microbial diversity?

腸道中存在種類繁多的微生物，腸道菌群失調(diào)與多種疾病如結(jié)直腸癌、腹瀉、炎癥性腸炎，乃至慢性代謝性疾病如肥胖、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展都有直接或間接的關(guān)系。維持腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的健康平衡狀態(tài)，對于人體健康具有重大的意義。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，已解決了不可培養(yǎng)微生物研究的難題，使得腸道微生物的研究進入一個新的階段，NGS高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使得研究者可以基于16S/18S/ITS序列的擴增，獲得龐大的數(shù)據(jù)信息，通過生物信息學手段，對大量數(shù)據(jù)進行PCA和PCoA分析，得出發(fā)病前后樣本間腸道微生物主要組成成分是否存在差異；并進一步通過RDA分析，找到與環(huán)境因子（疾病等）相關(guān)的微生物群落組成。

研究現(xiàn)狀

1、Tingting Wang等采用454測序技術(shù)研究結(jié)直腸癌（CRC）患者與正常人群腸道微生物的菌落組成差異。并結(jié)合real-time PCR對相關(guān)基因進行分析，最終確定丁酸鹽產(chǎn)生菌的減少和一些致病微生物的增加使得CRC患者腸道微生物菌落的失衡。

Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers Tingting Wang, Guoxiang Cai, Yunping Qiu, Na Fei, Menghui Zhang, Xiaoyan Pang,Wei Jia, Sanjun Cai and Liping Zhao The ISME Journal (2012) 6,320–329

研究對象：CRC患者46人，健康人群56人

主要結(jié)論：

（1）PCA主成分分析（圖a）和PCoA主坐標分析（圖b）顯示CRC患者與正常人腸道微生物存在差異。藍色圓圈代表正常人，紅色圓圈代表CRC患者

（2）對CRC患者與正常人樣本在98%相似水平上OTU的相對豐度進行RDA分析，找到健康人群與CRC疾病患者相關(guān)的微生物類群，進行分析與CRC疾病相關(guān)的主要微生物類群。有48個OTU可以作一個關(guān)鍵變量與CRC患者和正常人腸道微生物結(jié)構(gòu)差異存在顯著相關(guān)性。

（3）Heatmap分析：48個OTU的相對豐度作為健康人和CRC患者腸道微生物差異的主要變量，他們在樣本中的分布情況見下圖。圖左側(cè)黑色OTU代表在正常人中相對豐富，紅色OTU代表在CRC患者中相對豐富，每個樣本的顏色強度代表在所有樣本中的相對比率。

2、Larsen等研究二型糖尿病患者腸道微生物與非糖尿病人群的差異，采用454測序技術(shù)結(jié)合qPCR技術(shù)對36個樣本腸道微生物進行分析，結(jié)果表明二型糖尿病患者厚壁菌門和唆菌綱微生物比例較對照組顯著降低，但是變形菌綱微生物豐富。Bacteroidetes與Firmicutes的比例、Bacteroides-Prevotella group?與 C. coccoides-E. rectale group的比例與血糖濃度呈正相關(guān)，而與BMI（體重系數(shù)）無關(guān)。變形菌綱微生物同樣與血糖濃度呈正相關(guān)。

Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults Nadja Larsen,Finn K. Vogensen, Frans W. J. van den Berg,Dennis Sandris Nielsen,Anne Sofie Andreasen,Bente K. Pedersen,Waleed Abu Al-Soud,S?ren J. S?rensen,Lars H. Hansen,Mogens Jakobsen plos one,February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9085

研究對象：二型糖尿病患者18人，正常人18人

主要結(jié)論：

（1）Rarefaction Curve：確定取樣深度是否合理。

(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者與正常人腸道微生物在門與綱水平的差異。

我們的分析內(nèi)容：
技術(shù)路線

項目內(nèi)容

1 基因組抽提電泳檢測圖：

2 設(shè)計并合成引物
根據(jù)測序需求，設(shè)計16S和18S的最適宜引物，添加引物接頭，通過軟件分析檢測引物的可用性。 16S引物設(shè)計簡要圖

18S引物設(shè)計簡要圖

3 高通量測序
根據(jù)客戶的需求，采用不同的測序平臺進行高通量測序，Roche 454高通量測序平臺、Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺、MiSeq 高通量測序平臺等。
4 生物信息學分析
(1)根據(jù)barcode將大量的測序結(jié)果回歸樣本
(2)通過嚴密準確的程序，統(tǒng)計測序結(jié)果中的最終優(yōu)化序列
(3)OUT（Operational Taxonomic Units）分布統(tǒng)計
(4)菌群多樣性、豐度和測序深度指數(shù)計算及shannon指數(shù)曲線繪制

(5) 稀釋曲線（Rarefaction curve）：檢測樣品的取樣深度情況

(6)OTU分類學綜合信息表

 

(7)樣品OUT分布的比較–VEEN圖：統(tǒng)計多個樣品中所共有的 OTU 數(shù)目可以反映環(huán)境樣品的相似性及重疊情況

 

(8) 多樣品相似度比較

(9)微生物群落結(jié)構(gòu)分析

(10) PCA（Principal component analysis）：反映不同樣品中微生物群落組成的相似性以及影響微生物多樣性的主要因素

(11) PCoA (principal coordinate analysis)

(12) RDA（Redundancy analysis）：使用RDA分析，可進行與環(huán)境因子相關(guān)的微生物的篩選

送樣要求
送樣類型1
(1)樣品類型：糞便，新鮮取樣，凍存于-80℃
(2)樣品需求：≥2g
(3)樣品保存期間切忌反復凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸
(4)對于本種類型的樣品，我們將采用Qiagen QlAamp DNA tool Mini Kit進行基因組DNA抽提
送樣類型 2
(1) 樣品類型： DNA
(2) 樣品需求量：≥300ng
(3) 樣品濃度： ≥10ng/μL
(4) 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無降解
(5) 樣品保存期間切忌反復凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸
(6) 對于本種類型的樣品，我們在檢測完樣品的質(zhì)量后，進行PCR擴增等后續(xù)試驗。